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这篇综述聚焦人类蛋白质异构体（proteoforms）的化学合成。文中总结了化学蛋白质合成的发展，涵盖合成方法、产物表征及生物医学应用方面的进展。研究表明，虽方法有待完善，但分治策略可实现高效合成，合成的蛋白质异构体在生物医学研究中应用广泛。
### 一、引言
在人类健康和医学的生化研究领域，获取结构明确的人类蛋白质异构体（proteoforms）至关重要。蛋白质异构体是指由同一基因编码，但因翻译后修饰、可变剪接等过程而具有不同结构和功能的蛋白质。它们在细胞的生理和病理过程中发挥着关键作用，其结构和功能的异常与多种疾病密切相关 。化学蛋白质合成则为制备均一的蛋白质异构体提供了自下而上、原子分辨率的方法，能够在任意位置、以任意组合引入任意数量和结构的翻译后修饰（post - translational modifications，PTMs），这对于深入研究蛋白质异构体的功能和机制意义重大。
二、化学蛋白质合成的发展
- 早期发展：化学蛋白质合成的历史可以追溯到上世纪中叶。最初，人们尝试通过逐步连接氨基酸的方式合成简单的多肽。早期的合成方法面临诸多挑战，如反应条件苛刻、产率低、副反应多等，使得合成的蛋白质长度和复杂度受限 。但这些早期的探索为后续更高效的合成方法奠定了基础。
- 现代合成方法的突破：随着有机化学和生物化学技术的不断进步，化学蛋白质合成领域取得了一系列重要突破。如今，固相肽合成（Solid - Phase Peptide Synthesis，SPPS）技术成为了化学蛋白质合成的核心方法之一。SPPS 将氨基酸逐步连接到固相载体上，通过重复的偶联、脱保护等步骤实现多肽链的延伸，大大提高了合成效率和产物纯度 。此外，化学连接技术，如天然化学连接（Native Chemical Ligation，NCL）及其衍生方法，能够将多个合成的多肽片段连接起来，实现更长、更复杂蛋白质的合成 。这些技术的发展使得合成具有特定翻译后修饰的蛋白质异构体成为可能。
三、合成方法的最新进展
- 拓展合成范围：近年来，研究人员致力于拓展化学蛋白质合成的范围，以应对更复杂的蛋白质异构体。一方面，开发了新的氨基酸衍生物和保护基团，使得在合成过程中能够更好地控制反应选择性和修饰位点 。例如，通过设计特殊的保护基团，可以选择性地修饰特定的氨基酸残基，而不影响其他位点。另一方面，开发了新的连接策略，能够在更温和的条件下实现多肽片段的连接，减少对蛋白质结构的破坏 。这些方法的改进使得能够合成包含多种翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、乙酰化等的蛋白质异构体。
- 提高合成效率和准确性：为了提高化学蛋白质合成的效率和准确性，研究人员不断优化反应条件和合成流程。自动化合成仪器的出现，使得合成过程更加精确和高效，减少了人为操作带来的误差 。同时，开发了高通量的合成技术，能够在短时间内合成大量不同的蛋白质异构体，为大规模的功能研究提供了可能 。此外，实时监测合成过程的技术也得到了发展，通过质谱、核磁共振等手段，可以及时检测反应的进程和产物的质量，确保合成的准确性。
四、产物表征
- 结构表征：准确表征合成的蛋白质异构体的结构是验证合成方法有效性和研究其功能的基础。常用的结构表征技术包括质谱（Mass Spectrometry，MS）、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、X 射线晶体学（X - ray Crystallography）等 。质谱能够精确测定蛋白质的分子量，确定翻译后修饰的类型和位点；核磁共振可以提供蛋白质的三维结构信息，研究其在溶液中的构象变化；X 射线晶体学则能够获得高分辨率的蛋白质晶体结构，直观地展示蛋白质的原子排列。这些技术的结合使用，可以全面、准确地解析蛋白质异构体的结构。
- 功能表征：除了结构表征，对合成蛋白质异构体的功能进行表征也至关重要。功能表征的方法多种多样，取决于蛋白质的具体功能和研究目的。例如，对于酶类蛋白质异构体，可以通过测定其催化活性来评估功能；对于具有信号传导功能的蛋白质异构体，可以研究其与受体的相互作用以及对下游信号通路的影响 。此外，还可以利用细胞生物学和动物模型等手段，在体内环境中研究蛋白质异构体的功能，了解其在生理和病理过程中的作用机制。
五、生物医学应用
- 时空研究和相互作用网络分析：合成的蛋白质异构体为研究蛋白质在细胞内的时空分布和相互作用网络提供了有力工具。通过标记合成的蛋白质异构体，可以实时追踪其在细胞内的定位和动态变化，了解蛋白质在不同时间和空间的功能 。同时，利用蛋白质 - 蛋白质相互作用技术，如酵母双杂交、免疫共沉淀等，可以研究蛋白质异构体与其他蛋白质的相互作用，构建蛋白质相互作用网络，揭示细胞内的信号传导机制 。这些研究对于深入理解细胞的生理和病理过程具有重要意义。
- 活性量化和机制阐明：在药物研发过程中，准确量化蛋白质的活性以及阐明其作用机制是关键环节。合成的蛋白质异构体可以作为标准品，用于精确测定蛋白质的活性，评估药物对蛋白质活性的影响 。通过对合成蛋白质异构体的结构和功能研究，可以深入了解蛋白质的作用机制，为药物设计提供理论依据 。例如，针对特定疾病相关的蛋白质异构体，设计能够特异性调节其活性的药物分子，有望开发出更有效的治疗方法。
- 诊断和治疗的开发与评估：合成的蛋白质异构体在诊断和治疗领域也具有广阔的应用前景。在诊断方面，利用蛋白质异构体的特异性，可以开发更精准的诊断试剂，提高疾病诊断的准确性 。例如，检测特定疾病相关的蛋白质异构体的表达水平或修饰状态，可以作为疾病诊断和预后评估的生物标志物 。在治疗方面，合成的蛋白质异构体可以直接作为治疗药物，或者作为药物研发的模板，开发新型的治疗策略 。例如，设计具有特定功能的蛋白质异构体，用于补充体内缺失或功能异常的蛋白质，或者调节异常的信号通路，达到治疗疾病的目的。
六、分治策略在蛋白质异构体合成中的应用
- 策略原理：分治策略（divide - and - conquer strategy）是化学蛋白质合成中一种有效的方法。它将复杂的蛋白质异构体分解为多个较小的片段，分别进行合成，然后通过化学连接技术将这些片段连接起来，形成完整的蛋白质异构体 。这种策略的优势在于可以降低合成的难度，提高合成的效率和成功率。每个片段的合成相对简单，可以更好地控制反应条件和修饰位点，减少副反应的发生。同时，通过对片段的独立优化和表征，可以提高最终产物的质量。
- 应用实例：在实际应用中，分治策略已经成功应用于多种复杂蛋白质异构体的合成。例如，对于一些含有多个翻译后修饰的大型蛋白质异构体，研究人员将其分成几个较小的片段，分别合成并修饰，然后通过天然化学连接等技术将这些片段连接起来，得到了结构和功能均符合要求的蛋白质异构体 。这种策略不仅提高了合成的效率，还为研究蛋白质异构体的结构和功能提供了更灵活的方法。
七、挑战与展望
- 面临的挑战：尽管化学蛋白质合成在人类蛋白质异构体的制备方面取得了显著进展，但仍然面临一些挑战。首先，合成方法的成本较高，限制了其大规模应用。合成所需的氨基酸衍生物、保护基团和特殊试剂价格昂贵，合成过程中还需要使用高端的仪器设备，增加了成本 。其次，对于一些复杂的蛋白质异构体，合成的产率和纯度仍然有待提高。复杂的翻译后修饰和蛋白质结构可能导致合成过程中的副反应增加，影响产物的质量 。此外，合成方法的通用性还需要进一步提高，目前的方法在某些蛋白质异构体的合成上可能存在局限性。
- 未来展望：未来，化学蛋白质合成领域有望在多个方面取得进一步发展。一方面，研究人员将继续开发更高效、低成本的合成方法，降低合成成本，提高合成效率和产率 。例如，开发新的催化剂和反应体系，简化合成步骤，减少试剂的使用量。另一方面，将进一步拓展合成方法的应用范围，实现对更多复杂蛋白质异构体的合成。同时，随着技术的不断进步，蛋白质异构体的表征技术也将更加精确和灵敏，为深入研究蛋白质异构体的结构和功能提供更有力的支持 。此外，合成的蛋白质异构体在生物医学领域的应用将更加广泛，有望为疾病的诊断、治疗和药物研发带来新的突破。
综上所述，化学蛋白质合成在人类蛋白质异构体的制备方面取得了重要进展，为生物医学研究提供了有力的工具。通过不断改进合成方法、提高产物表征技术和拓展生物医学应用，化学蛋白质合成将在未来的生命科学和健康医学领域发挥更加重要的作用。
