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这篇综述聚焦骨肉瘤（OS），深入探讨肿瘤微环境（TME）在其进展和耐药中的关键作用。详细剖析了间充质基质 TME、免疫微环境等多个方面，并介绍了免疫疗法等创新治疗策略，为骨肉瘤治疗研究提供了全面且有价值的参考。
### 1. 骨肉瘤现状与肿瘤微环境的重要性
骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种罕见的恶性原发性骨肿瘤，主要影响儿童和年轻人。尽管癌症治疗取得了进展，但 OS 的治疗效果和患者预后改善有限。传统治疗手段如手术和化疗长期占据主导，生存率提升幅度较小，靶向治疗也因疾病的复杂性和异质性成效不佳。
近年来，肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）在肿瘤进展和治疗耐药中的重要性日益凸显，尤其是在 OS 中。OS 的 TME 具有独特特征，细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）改变、免疫细胞相互作用异常以及缺氧环境等，都对肿瘤行为和治疗反应产生重要影响。因此，深入了解 OS 微环境的复杂动态，对揭示肿瘤发展和进展机制至关重要。
本文围绕 OS 微环境的四个关键方面展开：间充质基质 TME、免疫微环境、缺氧的影响以及物理微环境的作用，探讨它们在 OS 进展和耐药中的作用机制。此外，还研究了近年来用于 OS 临床试验的免疫疗法，以及如抗 GD2 抗体、嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）等新治疗方法的潜力。
2. 间充质基质细胞在骨肉瘤进展中的作用
间充质基质 TME 在 OS 的发生和发展中起着关键作用。它由多种胚胎中胚层来源的非恶性宿主细胞组成，包括间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）、癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts，CAFs）、成骨细胞、脂肪细胞和内皮细胞等。这些细胞通过释放生长因子、外泌体包裹的 RNA 和代谢物以及细胞因子等，共同促进肿瘤的维持和发展，包括增强血管形成、肿瘤扩张、侵袭和促进癌症干细胞（Cancer Stem Cell，CSC）表型。
间充质 TME 中的细胞还参与合成异常的 ECM，其中包含在正常组织中罕见的蛋白质异构体，如癌胚形式的纤连蛋白。这些异常的 ECM 蛋白异构体促进肿瘤进展，也为 OS 的抗癌治疗提供了位点特异性递送的机会，例如针对癌胚纤连蛋白的抗体可用于引导抗癌药物的靶向递送。
大量研究表明，MSCs 在 OS TME 中对肿瘤细胞的命运和行为具有重要影响。MSCs 通过细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）与肿瘤细胞共享生物分子，促进 OS 细胞增殖、侵袭和转移。例如，骨髓来源的 MSCs 产生的 EVs 中的微小 RNA miR-21-5p，可上调 OS 中的 PI3K/AKT 激酶和刺猬（Hedgehog，Hh）通路，以及参与胶原蛋白翻译后修饰的 COLGALT2 蛋白表达。此外，MSCs 还可通过分泌炎症细胞因子，如 IL-12、MIF、IL-6 和 IL-8 等，促进 OS 细胞的增殖、迁移和转移，并增强其对化疗的耐药性。
值得注意的是，OS 细胞也能塑造间充质基质 TME 的组成和活性，促进自身的增殖和恶性进展。OS 细胞通过分泌 CCL2/MCP-1、GRO-α 和 TGF-β1 等吸引骨髓来源的 MSCs，并诱导其转分化为 CAFs。这些 CAFs 与天然成纤维细胞不同，会分泌更多的 CCL2、GRO-α、IL-6 和 IL-8，导致癌细胞发生间充质向阿米巴样转变、跨内皮迁移和转移。同时，OS 细胞增殖导致的酸中毒可激活 MSCs 中的 NF-κB，增强其分泌炎症细胞因子的能力，进一步促进 OS 的发展和化疗耐药。
单细胞 RNA 测序（Single-Cell RNA Sequencing，scRNAseq）研究揭示了 OS 间充质 TME 中高度的细胞复杂性和肿瘤间异质性。研究发现了多种不同的细胞类型和细胞簇，且不同样本中这些细胞的相对丰度差异很大。此外，基于受体 - 配体配对的通讯网络分析证实了 MSCs 在与 OS 细胞和 TME 其他成分通讯中的重要作用，同时也提出了 OS 癌细胞发生转分化的可能性，产生具有成纤维细胞、成软骨细胞和成肌细胞特征的恶性细胞亚群。
3. 免疫微环境：巨噬细胞、破骨细胞和 T 细胞在骨肉瘤中的作用
过去十年，高通量技术和计算分析工具的发展，使人们对肿瘤细胞与免疫微环境细胞之间的相互作用有了更深入的了解，这为 OS 患者的治疗分层提供了新的依据。OS 的 TME 是骨髓，这是一个由骨、免疫、基质和血管细胞组成的高度动态环境，嵌入矿化的 ECM 中。在 OS 中，不仅存在导致成骨 / 间充质来源细胞遗传不稳定的分子事件，还存在骨免疫平衡的破坏，涉及肿瘤细胞、免疫细胞以及成骨和破骨细胞之间的相互作用失调。
免疫细胞可分为髓系和淋巴系，髓系来源的细胞在 OS 微环境中占主导地位。这些髓系细胞具有高度可塑性，根据所遇到的刺激，可表现出促肿瘤或抗肿瘤的特性。然而，由于常用的细胞群区分生物标志物不够精确，这种分类在一定程度上是理论性的。
通过对临床数据和多种组学数据的综合分析，可将 OS 患者分为不同的亚组，如具有显著 MYC 扩增或同源重组缺陷的患者、免疫冷肿瘤患者和免疫热肿瘤患者。其中，免疫微环境富含髓系细胞，如单核细胞、肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages，TAMs）、树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）和中性粒细胞，但肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes，TILs），包括 CD8+、CD4+、调节性 T 细胞（Regulatory T cells，T-reg）和自然杀伤（Natural Killer，NK）细胞等相对缺乏，整体呈现免疫抑制状态。
scRNAseq 研究进一步证实了 OS 细胞及其免疫微环境的极端异质性。在髓系细胞中，单核细胞和巨噬细胞占 70 - 80%，DCs 占 5%，中性粒细胞较少。研究还鉴定出不同亚型的 TAMs，如 M1-TAMs 表达炎症因子，激活促炎信号通路；M2-TAMs 是主要的肿瘤相关抗炎巨噬细胞，但部分 M2-TAMs 也表达 M1-TAM 标记基因，表明 M1 和 M2-TAMs 之间存在动态转化；M3-TAMs 是具有促炎活性的 FABP4+肺泡巨噬细胞亚型。此外，髓系来源的 CD1c+ DCs 对激活 CD8 T 细胞至关重要，可作为潜在的治疗靶点。
破骨细胞在 OS 中通常与不良的治疗反应和预后相关。研究发现，根据 TME 细胞的分子特征可将患者分为预后良好和不良两组，后者与血管生成和破骨细胞活性相关。同时，TAMs 与破骨细胞的相互作用会抵消唑来膦酸的有益作用，这可能是由于唑来膦酸对促炎巨噬细胞亚群产生了负面影响。此外，研究还鉴定出破骨细胞的不同亚群，其基因表达谱随成熟度而变化，且破骨细胞分化相关基因可作为 OS 患者生存的关键预测指标。
对不同 TIL 亚群的基因表达谱分析显示，OS 微环境中淋巴细胞浸润较低，且 CD8、CD4、T-reg 和 NK 细胞等表达较高水平的 T 细胞耗竭抑制受体，如 TIGIT。这为使用 TIGIT 受体抑制剂提供了新的治疗思路。同时，OS 肿瘤中 T 细胞受体（T Cell Receptor，TCR）克隆多样性较低，可能与适应性免疫抵抗机制有关，包括 PD-1、CTLA-4、IDO 表达增加，髓系来源的抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells，MDSCs）存在，以及主要组织相容性复合体 I 类基因（Major Histocompatibility Class I genes，MHC-I）水平较低等。
一些研究表明，新辅助化疗可改变局部肿瘤免疫景观，增加 CD3+ T 淋巴细胞、CD8+ T 淋巴细胞和 PD-L1+免疫细胞的数量，同时减少 HLA-DR-CD33+ MDSCs，使肿瘤对免疫激活疗法更敏感。此外，抑制集落刺激因子 1（Colony-Stimulating Factor 1，CSF-1）可耗竭 TAMs 和 FOXP3+调节性 T 细胞，增强 CD8+ T 细胞浸润，为骨肉瘤的免疫治疗提供了新策略。同时，全身感染对 OS 生长的影响也为免疫调节治疗提供了新的探索方向，如 TLR4 激动剂可通过刺激 CD8+ T 细胞抑制 OS 进展。
4. 骨肉瘤中新生血管生成和缺氧的影响
缺氧是 OS 细胞与 TME 相互作用的关键因素，当组织氧浓度低于正常细胞功能所需水平时就会出现缺氧。在骨骼中，生理氧张力通常低于 9%。肿瘤细胞的快速增殖和氧气供应不足导致缺氧，缺氧驱动的机制具有多面性，不仅影响 OS 细胞本身，还广泛影响 TME 的多个成分，包括免疫细胞、血管生成细胞、成纤维细胞和 ECM。
缺氧诱导因子（Hypoxia-Inducible Factor，HIF）蛋白家族是细胞适应缺氧的关键转录因子。HIF 由组成型表达的 HIF1β 亚基与在急性缺氧下积累的 HIF1α 或慢性缺氧下积累的 HIF2α 亚基二聚化形成，然后结合到缺氧调节靶基因的调控区域上的缺氧反应元件（Hypoxia Response Elements，HREs），调节众多影响肿瘤活动的功能通路，如葡萄糖转运蛋白 GLUT-1（SLC2A1）参与的细胞代谢通路、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）介导的新生血管生成通路以及 WNT/β-catenin 信号通路等，这些通路的调节导致肿瘤细胞耐药性和侵袭性增强。
研究表明，HIF 家族成员及其靶标的过表达是 OS 耐药和预后不良的生物标志物。HIF2α 的表达不仅促进 OS 细胞增殖，还诱导肿瘤细胞异质性，导致治疗效果不佳。缺氧驱动的通路激活 PI3K/PTEN/AKT 通路，维持肿瘤细胞在缺氧条件下的生长和异质性。同时，为适应低氧环境，OS 细胞的代谢活动发生改变，糖酵解和谷氨酰胺分解是驱动 OS 侵袭性的主要代谢途径，但目前尚未确定可用于基于转录组学的 OS 代谢分类的特定代谢特征。
缺氧与 OS 细胞和免疫 TME 之间存在密切关系。M1/M2 巨噬细胞的存在可能与 mTOR/HIF1 通路的调节表达有关，HIF1α 的增强表达与促肿瘤巨噬细胞和破骨细胞的存在显著相关，这种相关性影响 OS 的生长和侵袭性，也可作为预后不良的预测指标。此外，缺氧诱导的基质硬度调节和新生血管生成对 TME 中的细胞营养和生物力学刺激具有重要影响，新生血管生成主要由缺氧的肿瘤内微环境诱导，通过激活 VEGF/VEGFR 通路促进 OS 的局部和远处侵袭。基于这些发现，通过靶向治疗策略对 OS 组织进行 “再氧合”，可能有助于增强化疗敏感性或治疗疾病复发。
5. 骨肉瘤的物理微环境
骨骼是一种动态组织，一生中不断由成骨细胞和破骨细胞进行重塑。健康的骨组织具有各向异性，其机械性能在不同方向上有所不同。在 OS 中，快速的骨重塑可导致骨结构异常，表现为高度各向同性（随机取向），这是由于骨基质的变化，尤其是骨单位和胶原纤维排列的改变。这些变化是异质性的，包括成骨（骨形成）、溶骨（骨吸收）或混合性改变，侵袭性 OS 通常以加速的骨吸收和不连续的骨边界为特征，导致肿瘤物理微环境发生显著变化，包括 ECM 特性、细胞力学和机械力的改变。
物理微环境和生物力学特性在 OS 的进展和化疗耐药中起着重要作用。ECM 在 OS 中高度动态变化，其生化和生物力学信号影响细胞迁移和增殖。ECM 的变化源于其组成成分的改变以及空间排列和交联方式的变化。例如，胶原蛋白分泌增加导致其在骨基质中的沉积增多，以及胶原纤维之间交联增加，均可使 ECM 硬度增加。ECM 硬度的增加影响基质孔隙率和整合素介导的细胞粘附，进而调节细胞行为和对化疗的反应。临床研究发现，胶原模式的改变是多种癌症（包括 OS）的预后因素，不同类型的胶原蛋白与临床分期、转移和治疗反应相关。此外，OS 细胞产生的矿化 ECM 具有不规则形状和随机分布的孔隙，胶原纤维取向也存在差异，表现为胶原密度低且纤维短。
骨 ECM 的蛋白聚糖组成在 OS 中也发生改变。例如，多功能蛋白聚糖 versican 在 OS 组织中的表达相对于正常组织增加，其表达受 TGF-β1 上调，可增强 OS 细胞的运动性。同时，CD44 在转移性和复发性 OS 患者肿瘤标本中的表达高于原发性肿瘤，CD44 与透明质酸（Hyaluronic Acid，HA）结合，可增强 OS 细胞的肺转移和化疗耐药性。
肿瘤细胞可通过增加 ECM 蛋白的沉积和交联使周围基质变硬，致密的 ECM 会阻碍治疗药物进入肿瘤组织。因此，肿瘤阻断疗法是一种潜在的治疗策略，如使用聚合物 DPA 在肿瘤周围引发生物矿化，形成矿物屏障抑制癌细胞增殖和迁移，同时发挥抗破骨细胞作用，减缓 OS 进展。
基质硬度对细胞反应具有重要影响。OS 组织比其起源的刚性骨组织更弱、更具顺应性。在不同硬度的底物上培养 OS 细胞，其反应不同。例如，U2OS 细胞在较硬的底物（50 kPa）上培养时，球形生长最佳，CSC 标记物表达增加；而 MG63 细胞在高基质硬度下，细胞形态发生改变，促进上皮 - 间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）和迁移。此外，基质硬度还影响 OS 细胞中肌动蛋白聚合、细胞骨架重塑以及相关蛋白的转位。同时，降低 3D 底物硬度可导致 OS 细胞中 YAP 和 TAZ 蛋白的核定位增加，以及 IGF-1R 和 mTOR 表达下调，影响下游信号通路。
ECM 的拓扑特征也是物理微环境的关键结构特征。接触导向是一种由基质拓扑结构驱动的细胞反应，健康成骨细胞会根据基质的几何特征排列细胞核，而随着 OS 进展，OS 细胞对拓扑变化的敏感性降低。例如，SaOs-2 细胞可重塑细胞核以适应 3D 微米尺寸柱子之间的空间，这种核变形与肌动球蛋白收缩性和核细胞骨架连接有关。此外，较高的底物粗糙度可增强 MG63 细胞的粘附，但会抑制细胞铺展。
目前研究 OS 生物学的体外方法主要依赖单层细胞培养，无法模拟物理 TME 提供的关键机械信号。组织工程研究致力于开发具有骨模拟成分的工程支架，如基于胶原蛋白的支架，可通过调整其成分、硬度和孔隙率来更好地模拟骨 ECM，促进成骨。为更准确地反映骨微环境的硬度，可通过添加聚乳酸纤维或锌等方式提高矿化胶原蛋白支架的机械强度。同时，利用实时变形细胞术等技术对 OS 细胞和相关细胞类型的机械表型进行研究发现，侵袭性 OS 细胞具有独特的形态和机械特性，细胞力学可能作为 OS 患者循环肿瘤细胞的潜在预后标志物。此外，研究还发现 OS 细胞与微环境中其他正常细胞的相互作用存在差异，基于此可对 OS 进行分类，并建立了基于 TME 的预后指数，为患者生存和对免疫检查点抑制剂治疗的反应提供预测。同时，TME 中的流体流动剪切应力等外力也可调节 OS 细胞的 YAP 表达，影响其成骨分化和肿瘤发生，调节流体运动可能成为一种新的治疗途径。
6. 骨肉瘤治疗的创新方法：调控肿瘤微环境和免疫反应
寻找新的 OS 治疗策略越来越聚焦于调控肿瘤微环境及其免疫成分，以提高治疗效果和改善患者预后。针对免疫微环境的治疗在软组织和骨肉瘤（包括 OS）中已有较长历史，但大多数免疫治疗试验至今未取得成功。
最初的策略是使用干扰素 - α 刺激免疫系统。例如，EURAMOS-1 试验研究了聚乙二醇化干扰素 α-2b（IFN-α-2b）作为维持治疗对化疗反应良好的 OS 患者的疗效。干扰素具有抗血管生成、直接抗肿瘤和免疫刺激特性，但该方法并未改善患者生存。随后，基于术后细菌感染可改善 OS 预后的证据，将胞壁酰三肽 - 磷脂酰乙醇胺（Muramyl Tripeptide-Phosphatidyl Ethanolamine，MTP-PE）添加到化疗中，结果显示总体生存率有统计学意义的提高，无事件生存率也有改善趋势。基于此，脂质体形式的 MTP-PE（L-MTP-PE；米伐木肽）被欧洲药品管理局批准用于治疗 30 岁以下新诊断的高危非转移性 OS 患者。然而，MTP-PE 对单核细胞 / 巨噬细胞和相关全身细胞因子释放的影响与患者预后之间的关系尚不清楚，且在转移性 OS 中，其对疾病控制的效果有限，可能是由于对巨噬细胞的激活缺乏特异性。
免疫检查点抑制剂策略在肉瘤治疗中受到广泛关注，其原理是去除免疫系统的 “刹车”，激活 T 细胞。目前多项临床研究正在探索使用抗 CTLA-4 抗体（如曲美<
