工程化核质穿梭载体实现可编程编辑器的模块化装载：基因治疗递送系统的重大突破

《Cell》：Engineered nucleocytosolic vehicles for loading of programmable editors

本研究针对基因编辑工具（如CRISPR-Cas9、碱基编辑器BE和先导编辑器PE）递送效率低、稳定性差等关键问题，开发了名为ENVLPE+的病毒样颗粒（VLP）系统。通过核质穿梭机制和Csy4介导的pegRNA 3'端保护策略，实现了RNP复合物的高效装载与递送，在体外和体内（包括视网膜疾病小鼠模型）展现出显著优于现有VLP系统的编辑效率，为遗传病治疗提供了新型递送平台。

　　

基因编辑技术的快速发展为遗传病治疗带来了革命性机遇，但如何安全高效地将编辑器递送至靶细胞仍是重大挑战。传统病毒载体存在免疫原性、插入突变等风险，而非病毒递送系统又面临细胞特异性差、编辑效率低等问题。尤其对于需要瞬时表达的编辑器（如先导编辑器PE），现有递送工具难以兼顾高效性与安全性。更棘手的是，先导编辑所需的pegRNA因其3'端延伸结构极易降解，严重制约了编辑效率。

针对这些瓶颈，德国慕尼黑工业大学和亥姆霍兹慕尼黑中心的研究团队开发了名为ENVLPE+（Engineered Nucleocytosolic Vehicles for Loading of Programmable Editors）的革命性递送系统。该系统通过工程化改造HIV-1 Gag蛋白，引入核定位信号（NLS）与核输出信号（NES），构建出能在核质间主动穿梭的载体，可捕获细胞核内预组装的编辑器核糖核蛋白复合物（RNP）。研究还创新性地采用Csy4核酸酶保护pegRNA 3'端，显著提高了先导编辑器的稳定性。该成果发表于《Cell》期刊，为基因治疗提供了兼具高效性与安全性的递送方案。

关键技术包括：1）构建含PP7衣壳蛋白（PCP）的Gag突变体，通过PP7-pegRNA适配体相互作用实现RNP特异性装载；2）开发Csy4-C4 RNA保护模块稳定pegRNA；3）建立最小化包装系统miniENVLPE；4）使用VSV-G/MMLV-Env伪型化实现细胞靶向；5）通过视网膜疾病（rd6/rd12）小鼠模型验证治疗效果。

在"Gag-PCP穿梭实现(pe)gRNA高效装载"部分，研究团队将PP7衣壳蛋白（PCP）整合至HIV-1 Gag的NC结构域，同时引入L21S突变增强膜靶向。通过荧光报告系统证实，核质穿梭功能使PE编辑效率提升3倍，且编辑器主要以RNP形式递送。优化后的3'PP7-pegRNA设计较传统tetraloopPP7版本编辑效率提高40%。

关于"Cas9效应子的递送应用"，ENVLPE系统成功实现了：1）在HEK293T细胞中通过同源定向修复（HDR）完成244bp大片段插入；2）在T淋巴细胞中实现B2M和TRBC1/2位点的高效碱基编辑（>80%），为CAR-T细胞治疗提供新策略；3）通过dCas9-miniVPR激活MAPT基因表达，证实其适用于CRISPRa应用。

研究最具突破性的发现体现在"Csy4保护显著提升先导编辑效率"部分。将Pseudomonas aeruginosa的Csy4核酸酶与pegRNA的C4适配体结合后，先导编辑效率提升达10倍。冷冻电镜显示ENVLPE+颗粒直径仅31.5nm，但每个VLP平均装载78个Cas9蛋白和77条pegRNA，RNP装载效率显著高于传统PE-eVLP系统。

在动物实验中，ENVLPE+在rd6小鼠模型（Mfrp基因修复）和rd12小鼠模型（Rpe65基因矫正）均展现出卓越疗效：1）蛋白表达恢复水平较v3 PE-eVLP提高8倍；2）视网膜电图（ERG）显示视觉功能显著改善；3）高效液相色谱（HPLC）检测到11-顺式视黄醛恢复至野生型20%水平。

这项研究开创性地解决了基因编辑器递送的关键技术瓶颈。ENVLPE+系统具有三大核心优势：1）模块化设计适配多种编辑器（PE/BE/nCas9）；2）核质主动运输确保RNP完整性；3）Csy4保护机制显著提升pegRNA稳定性。相比传统VLP，其"每颗粒编辑效率"提高26-40倍，为遗传性视网膜疾病等难治性疾病的基因治疗提供了全新解决方案。未来通过优化靶向递送和组织特异性，该技术有望拓展至更多遗传病治疗领域。