靶向核糖核酸外切酶 XRN1：癌症治疗新策略及强效抑制剂的发现

在癌症治疗研究中，为探索 XRN1 作为癌症靶点的作用及寻找其抑制剂，研究人员利用非小细胞肺癌细胞系开展相关研究。结果表明 XRN1 是部分癌细胞增殖所必需，且发现腺苷 - 3’,5’ - 二磷酸（pAp）是其强效抑制剂。这为癌症治疗提供了新方向。

　　在癌症治疗的探索之路上，科学家们一直致力于寻找新的靶点和有效的治疗策略。近年来，随着对细胞内 RNA 代谢机制研究的深入，一种名为核糖核酸外切酶 1（XRN1_{，5’ - 3’ exoribonuclease 1}）的蛋白进入了人们的视野。XRN1 能够从 5’到 3’方向降解 RNA，参与多种细胞内重要功能，如 mRNA 周转以及调节细胞对病毒感染的反应，同时还能防止内源性双链 RNA（dsRNA）积累。以往的研究发现，高水平的胞质 dsRNA 具有免疫原性，可激活先天 dsRNA 传感通路，在病毒感染时引发抗病毒反应。而在癌症治疗中，利用这一机制，通过增加癌细胞内 dsRNA 负担来诱导细胞凋亡成为了研究热点。然而，XRN1 在癌症中的具体作用以及能否成为有效的治疗靶点，还存在许多未知。
为了深入探究这些问题，来自美国 Accent Therapeutics 的研究人员展开了一系列研究。他们的研究成果发表在《Communications Biology》上，为癌症治疗带来了新的曙光。
研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，他们选取了非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系，包括 NCI - H1650、NCI - H1703、NCI - H838 和 NCI - H1944 等细胞株，通过 CRISPR 基因编辑技术敲除 XRN1 基因，观察细胞的增殖、凋亡情况以及相关信号通路的变化。在蛋白质研究方面，构建并纯化了多种 XRN1 蛋白变体，利用荧光标记的 RNA 底物进行酶活性检测，同时运用表面等离子共振（SPR）技术研究蛋白与底物或抑制剂的结合特性。此外，还通过结晶和 X 射线衍射技术解析了 XRN1 与抑制剂结合的晶体结构。
下面来看具体的研究结果。
验证 XRN1 作为非小细胞肺癌的癌症靶点：研究人员依据公开的 CRISPR 筛选数据，对不同的 NSCLC 细胞系进行研究。结果显示，在 XRN1 敏感的细胞系如 NCI - H1650 和 NCI - H1703 中，敲除 XRN1 会显著降低细胞集落形成能力，抑制细胞增殖，同时促进细胞凋亡；而在 XRN1 不敏感的细胞系 NCI - H838 和 NCI - H1944 中，敲除 XRN1 对细胞增殖没有明显影响。进一步研究发现，敲除 XRN1 后，XRN1 依赖的细胞系中 pPKR（磷酸化的蛋白激酶 R）水平显著上调，同时 I 型干扰素基因表达也明显增加，这表明 XRN1 的缺失激活了 dsRNA 传感通路，进而诱导细胞死亡，验证了 XRN1 在部分 NSCLC 细胞系中是潜在的癌症治疗靶点。
XRN1 蛋白构建体设计：由于 XRN1 的催化活性对其抑制癌细胞增殖的作用至关重要，研究人员致力于构建高质量的 XRN1 蛋白用于后续研究。他们尝试了多种表达系统，最终通过设计 C 末端截断的 XRN1 构建体（hXRN1），从哺乳动物细胞中成功纯化出高纯度、足够产量的蛋白，为后续的药物研发奠定了基础。
XRN1 核酸酶活性测定方法的开发：研究人员以一种荧光标记的 RNA/DNA 杂交底物为基础，对 XRN1 的酶活性测定方法进行优化。确定了最佳反应缓冲液条件，包括 20 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、5 mM MgCl2 、1 mM DTT、0.01% BSA、0.004 U/μL RNaseOUT 和 0.01% Tween - 20。在此条件下，对 hXRN1 和活性位点突变体 hXRN1^D208A的酶活性进行测试，发现突变体无酶活性。通过稳态酶动力学分析，得到 hXRN1 的底物 KM 值为 0.4 ± 0.03 nM，kcat 为 0.21±0.02 min?1 ，并确定了最终的 RNA/DNA 底物浓度为 1.5 nM。
XRN1 和 XRN2 的 SPR 测定方法开发：为了进一步验证化合物与 XRN1 的结合特性，研究人员开发了 XRN1 的 SPR 测定方法。他们构建了带有 C 末端 Avi 标签的 hXRN1 和 hXRN1^D208A蛋白（hXRN1 - Avi 和 hXRN1^D208A - Avi），并利用单链 DNA 作为阳性对照进行实验。结果发现，单链 DNA 与 hXRN1 - Avi 的结合呈现浓度依赖性，但结合曲线不符合 1:1 结合模型，而与催化失活的 hXRN1^D208A - Avi 的结合曲线符合预期。同时，研究人员还开发了 XRN2 的 SPR 测定方法，构建了 hXRN2 蛋白及其 Avi 标签变体 hXRN2 - Avi，为评估化合物对 XRN1 和 XRN2 的选择性提供了手段。
pAp 的体外特性表征：研究人员对已知的 XRN1 抑制剂腺苷 - 3’,5’ - 二磷酸（pAp）进行研究。令人惊讶的是，通过酶活性测定和 SPR 实验发现，pAp 对 XRN1 具有很强的抑制作用和结合能力，其对 hXRN1 的 IC50 值为 36 ± 10 nM，对 hXRN1 - Avi 的 KD 值为 12 ± 1 nM，对 hXRN2 - Avi 的 KD 值为 14 ± 4 nM。进一步研究表明，pAp 与 XRN1 的结合是通过双金属活性位点，且抑制方式为混合竞争抑制。
人 XRN1 催化结构域与 pAp 结合的晶体结构：为了更深入了解 pAp 与 XRN1 的结合模式，研究人员解析了人 XRN1 催化结构域（hXRN1x）与 pAp 结合的晶体结构。结构显示，pAp 结合在双金属结合位点，其中镁离子与 pAp 及蛋白残基形成了多种相互作用。通过与其他相关结构的比较发现，XRN1 与 XRN2 在结构和序列上具有高度相似性，这解释了 pAp 对两者都有很强抑制作用的原因。
综合研究结果，XRN1 在部分肺癌细胞系中是细胞增殖所必需的，敲除 XRN1 可激活 dsRNA 传感通路，导致细胞死亡，这表明 XRN1 有望成为癌症治疗的新靶点。同时，研究发现 pAp 是 XRN1 的强效抑制剂，其结合模式和抑制机制也得到了深入解析，为后续开发更有效的 XRN1 抑制剂提供了重要依据。此外，XRN1 抑制与免疫检查点抑制剂联合使用可能是一种有效的癌症治疗策略，能够克服免疫治疗的耐药性。这项研究为癌症治疗开辟了新的方向，为开发新型抗癌药物提供了理论基础和潜在的药物靶点，具有重要的科学意义和临床应用前景。