揭秘铜绿假单胞菌在胃肠道定植的动态变化：构建模型洞察感染前机制

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是常见医院病原体。本文利用万古霉素预处理小鼠构建胃肠道定植模型，发现胃是定植主要屏障，细菌在小肠和盲肠大量繁殖。该研究对理解定植机制、预防感染意义重大，值得一读。

　　

引言

在全球范围内，细菌感染是导致死亡的重要因素之一，其中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）引发的多种医疗相关感染，严重威胁着住院患者、免疫功能低下者以及慢性肺病患者的生命健康。并且，铜绿假单胞菌对多种抗菌药物高度耐药，给治疗带来极大挑战。

在健康个体中，铜绿假单胞菌很少存在于胃肠道微生物群中，但在重症监护病房（ICU）患者、癌症患者以及长期护理机构居民中，其胃肠道定植率显著升高。更为关键的是，胃肠道定植是后续感染的重要危险因素，还可能导致细菌传播给其他患者。因此，深入了解铜绿假单胞菌在胃肠道的定植机制，对于预防感染、控制抗生素耐药性以及保障患者安全至关重要。

目前虽有多种动物模型用于研究铜绿假单胞菌的毒力和传播，但针对胃肠道定植的模型较少。先前的研究多依赖延长细菌暴露时间或使用免疫缺陷小鼠，与实际临床情况存在差异。本研究旨在通过抗生素处理免疫健全的动物，构建更接近 ICU 患者的铜绿假单胞菌胃肠道定植动物模型，并对定植的种群动态进行深入研究。

结果

1. 万古霉素促进铜绿假单胞菌胃肠道定植：在未用抗生素预处理的情况下，通过口胃管给予小鼠铜绿假单胞菌临床分离株 PABL048，无法在其胃肠道定植。而万古霉素是美国医院常用的抗生素之一，且对铜绿假单胞菌无活性。研究人员测试了三种万古霉素腹腔注射（IP）联合口胃管给予铜绿假单胞菌的方案，结果显示三种方案均能支持铜绿假单胞菌的胃肠道定植。其中，在口胃管给予铜绿假单胞菌前，连续 4 天腹腔注射万古霉素，给予细菌当天及之后 2 天继续注射万古霉素的方案，能使小鼠粪便中铜绿假单胞菌的载量更高。使用该方案处理小鼠后，其粪便中细菌载量在接种后第一周平均为 10⁶ - 10⁸ CFU/g，第二周虽有所下降，但仍保持在 10³ - 10⁷ CFU/g。此外，雄性和雌性小鼠的胃肠道定植情况相似。同时，研究人员还测试了另外六种临床分离株 PABL004、PABL006、PABL012、PABL048、PABL049 和 PABL054，发现尽管这些菌株在基因上存在差异且毒力不同，但在实验的前 10 天，它们在小鼠粪便中的细菌载量相似，且所有菌株都能持续定植。这表明万古霉素预处理可建立一个强大且可靠的模型用于研究铜绿假单胞菌的定植。
2. 铜绿假单胞菌定植不引起胃肠道炎症：为区分定植和感染，研究人员对小鼠胃肠道组织进行了组织病理学分析。给小鼠腹腔注射万古霉素或磷酸盐缓冲盐水（PBS），并在第 0 天经口胃管给予高剂量（10^7.1 CFU）的 PABL048 或 PBS（模拟对照）。在口胃管给予细菌后第 3 天，处死小鼠并取胃肠道器官进行组织学检查。结果显示，所有样本均未观察到炎症细胞或组织损伤，胃肠道各部分的组织结构保持正常。在接受 PBS 腹腔注射和铜绿假单胞菌口胃管给予的小鼠胃黏膜表面，观察到多灶性细菌聚集，但无法确定其死活。而在接种后 3 天，8 只接受 PBS 预处理的小鼠中只有 1 只粪便中培养出铜绿假单胞菌，其余 7 只未检测到细菌定植。在接受万古霉素预处理的小鼠中，只有 1/4 的小鼠胃黏膜表面有细菌，且粪便中检测到铜绿假单胞菌的小鼠，其小肠、盲肠和结肠的肠壁均未发现细菌入侵迹象，表明铜绿假单胞菌主要存在于胃肠道腔内。实验过程中，接受万古霉素预处理的小鼠无论后续是否接受铜绿假单胞菌灌胃，均出现了适度的体重减轻，但未出现系统疾病症状，这些结果表明该模型是铜绿假单胞菌的胃肠道定植模型而非感染模型。
3. 铜绿假单胞菌主要局限于胃肠道内：由于肠道被认为是免疫功能低下患者感染铜绿假单胞菌的主要来源，研究人员评估了该模型中铜绿假单胞菌是否会传播到其他组织。给小鼠经口胃管接种 10^7.4 CFU 的 PABL048 后，在接种后第 3、7 和 14 天对多个器官进行细菌计数。结果发现，大部分细菌存在于胃肠道器官中，包括胃、小肠、盲肠、结肠和粪便。在接种后的前 7 天，铜绿假单胞菌很少在胆囊、脾脏、肝脏或肺部被检测到，这表明在该模型中，细菌从肠道向其他器官的转移虽然很少见，但偶尔会发生，且没有明显的系统疾病症状。然而，在接种后 2 周，尽管胃肠道持续定植，但在小鼠的任何肠外部位都未观察到细菌，说明在该胃肠道定植模型中，铜绿假单胞菌从胃肠道传播到其他组织的情况较为罕见。
4. 铜绿假单胞菌建立长期定植：为进一步研究该模型，研究人员探究了单次口胃管给予铜绿假单胞菌后定植的持续时间。给小鼠接种 10^5.7 CFU 的 PABL048 后，所有小鼠的胃肠道至少在 10 天内都携带铜绿假单胞菌。在第 60 天，70%（10 只雌性中的 7 只，10 只雄性中的 7 只）的小鼠胃肠道仍在排出铜绿假单胞菌，这表明在该模型中，铜绿假单胞菌在单次暴露后可建立长期的胃肠道定植。
5. 胃是胃肠道定植的主要瓶颈：研究人员利用基于序列标签的微生物种群分析（STAMP）技术，结合 STAMPR 分析流程，对铜绿假单胞菌在胃肠道定植过程中的种群动态进行研究。他们使用了先前构建并验证的带有条形码的铜绿假单胞菌 PABL012 库（PABL012_pool），向经万古霉素处理的小鼠经口胃管给予 10^6.1 CFU 的 PABL012_pool，并在接种后 24、48 和 72 小时收集胃肠道各部分（胃、小肠、盲肠、结肠和粪便）进行分析。结果发现，胃肠道所有器官都支持 PABL012_pool的定植，其中胃中回收的总 CFU 变化最大，部分小鼠胃中已检测不到细菌，而部分小鼠胃中细菌载量可达 10^{4 - 5} CFU。在定植的前 3 天，盲肠和粪便中的细菌载量最高，且所有部位的 CFU 中位数在这 3 天内保持稳定，表明胃肠道定植在铜绿假单胞菌给予后的前 24 小时内建立，并在接下来的 2 天内维持稳定。通过分析发现，在所有器官和时间点，铜绿假单胞菌的 N_s值都很低，说明接种后细菌遇到了紧密的瓶颈。胃中的 N_s值最低，表明几乎所有最初接种到胃中的细菌在 24 小时内要么被杀死，要么被排入小肠。而远端胃肠道的 N_s值较高，说明部分细菌成功通过胃并在下游肠道定植。进一步研究发现，铜绿假单胞菌在近端胃肠道主要被杀死，而非快速传递到远端肠道并经粪便排出。
6. 小肠和盲肠支持铜绿假单胞菌的大量复制：不同器官中较高的 CFU 计数和相对较小的 founding population sizes 表明铜绿假单胞菌在胃肠道具有复制能力。研究人员通过计算 CFU 与 N_s的比值（净复制率）来评估细菌的复制情况，发现铜绿假单胞菌在盲肠中的净复制率最高，CFU/N_s比值大于 10⁵ ，在胃、小肠和结肠中也有显著的复制。为了确定细菌的复制方式，研究人员通过比较不同部位铜绿假单胞菌种群的遗传距离（GD）和分数弹性遗传距离（FRD）来分析其遗传相关性。结果发现，在所有时间点，盲肠、结肠和粪便中的铜绿假单胞菌条形码种群平均高度相似（GD 约为 0.06），小肠与盲肠、结肠和粪便之间的 GD 随时间下降。这表明铜绿假单胞菌在盲肠或小肠中能够快速大量繁殖，然后这些大量的细菌群体迁移到结肠并最终经粪便排出。此外，研究还发现，在接种后 24 小时，小肠中的独特克隆数比胃中多，这可能是由于细菌从小肠反流到胃，或者是最初胃和小肠接种的细菌种群相似，但胃中的部分细菌被快速清除。随着时间推移，到 72 小时时，胃肠道各部位的铜绿假单胞菌种群变得更加相似，GD 值几乎为 0，FRD 值为 1.0，表明此时胃肠道内携带的是均匀的铜绿假单胞菌种群。综合这些结果表明，万古霉素处理能够促进铜绿假单胞菌在胃肠道内的复制，而不仅仅是促进初始接种物在胃肠道内的短暂转移。

讨论

本研究建立了一种模拟医院环境中接受抗生素治疗患者的铜绿假单胞菌胃肠道定植小鼠模型。该模型使用万古霉素，且在雄性和雌性小鼠以及多种临床分离株中均得到验证，具有临床相关性。模型中胃肠道没有炎症反应，证实其为定植模型而非感染模型。不过，偶尔发生的铜绿假单胞菌向其他器官的低水平转移，提示了胃肠道定植可能导致远处感染的潜在途径。单次给予铜绿假单胞菌后，可建立长期的胃肠道定植，60 天后仍有 70% 的小鼠携带该菌。

通过使用条形码标记的细菌，研究发现大部分接种的细菌在最初 6 小时内被杀死，主要发生在胃中。少量存活的细菌到达小肠和盲肠后大量繁殖，随着细菌群体在盲肠和结肠中不受阻碍地迁移，最终导致大量细菌经粪便排出。

研究还发现，未经处理的小鼠不支持铜绿假单胞菌的胃肠道定植，而腹腔注射 7 天的万古霉素可促进高水平且持久的定植。推测万古霉素可能通过影响小鼠的微生物群，为铜绿假单胞菌创造了定植的生态位，也可能通过对宿主的直接免疫调节作用促进定植，目前研究人员正在进一步研究万古霉素促进定植的机制。

所有测试的六种临床分离株在胃肠道的定植程度相似，这表明铜绿假单胞菌建立胃肠道定植的能力可能依赖于细菌核心基因组编码的一组特征，但也不排除菌株特异性策略的作用。在患者中，铜绿假单胞菌的胃肠道定植是后续发生感染的预测指标。在本研究的小鼠模型中，接种细菌后不久，偶尔会发生细菌从肠道向其他器官的低水平传播，这可能解释了临床观察到的现象。并且，肠道菌群失调可能导致肠道屏障功能受损，使病原体分子易位进入血液，在免疫功能低下的动物中，这种传播可能会更加严重，导致更严重的感染。

利用 STAMPR 技术，研究确定了胃是铜绿假单胞菌定植的主要屏障，小肠和盲肠是细菌扩张的主要部位。本模型有助于进一步理解铜绿假单胞菌在胃肠道定植过程中的动态变化，可用于研究细菌在长期定植过程中的适应性、确定促进定植的细菌和宿主因素，以及研究除万古霉素外其他抗生素对定植的影响。此外，研究结果还具有临床意义，例如提示在预防铜绿假单胞菌胃肠道定植时，更谨慎地使用抑酸药物和万古霉素可能具有重要意义。

材料和方法

1. 细菌菌株和培养条件：PABL004、PABL006、PABL012、PABL048、PABL049 和 PABL054 是从芝加哥西北纪念医院患者血液中分离的铜绿假单胞菌临床菌株，保藏于实验室。除非另有说明，细菌从冷冻保存的菌株中划线接种到溶原肉汤（LB）或 Vogel - Bonner 基本培养基（VBM）琼脂平板上，然后在 37℃、振荡条件下在 LB 培养基中培养。当需要对铜绿假单胞菌进行抗生素筛选时，使用终浓度为 5μg/mL 的 irgasan 进行添加。
2. 胃肠道定植小鼠模型：选用 6 - 8 周龄的 C57BL/6 小鼠（购自 Jackson Laboratory），雌性小鼠腹腔注射 200μL、雄性小鼠腹腔注射 250μL 万古霉素（370mg/kg，Hospira，Lake Forest，IL），每天 1 次，连续 7 天。万古霉素的剂量是根据人体每日总剂量 30mg/kg 按比例缩放确定的。在抗生素治疗的第 5 天，小鼠经口胃管（20G×30mm 直型动物喂食针，Pet Surgical，Phoenix，AZ）给予 50μL 铜绿假单胞菌悬液。铜绿假单胞菌在 LB 培养基中过夜培养后，稀释并在 LB 培养基中重新生长至对数生长期，然后用 PBS 重悬至所需剂量。必要时，使用 PBS 进行模拟腹腔注射或模拟口胃管给予（体积与处理组相同）。从口胃管给予细菌后的第二天开始，每天更换小鼠笼子，以减少食粪行为的影响。为了确定细菌在胃肠道的定植情况，将小鼠单独置于小容器中诱导排便，收集粪便并称重，加入 1mL PBS 后使用 BeadBlaster（Benchmark Scientific，Sayreville，NJ）进行匀浆，然后在 1100×g 条件下离心 30 秒。取上清液进行系列稀释，并涂布在添加 irgasan 的 LB 琼脂平板或 VBM 琼脂平板上，用于 CFU 计数。小鼠饲养在西北大学比较医学中心的隔离病房，除非另有说明，实验均使用雌性小鼠。
3. PABL012_pool的小鼠胃肠道定植实验：6 - 8 周龄的雌性小鼠腹腔注射万古霉素（200μL，370mg/kg），连续 5 - 7 天，每个实验组在解剖前 24 小时进行最后一次注射。将 50μL 的 PABL012_pool库在 5mL LB 培养基中过夜培养（37℃，250rpm），然后以 1:40 的比例转接至 30mL LB 培养基中继续培养 3 小时。按照上述方法制备细菌接种物，并在万古霉素治疗的第 5 天经口胃管给予小鼠 10^6.1 CFU 的 PABL012_pool。接种细菌后，将小鼠单独饲养。在接种后 24、48 和 72 小时，对小鼠实施安乐死，收集胃、小肠、盲肠、结肠和粪便样本。胃、小肠和盲肠连同其腔内内容物一起处理，结肠排空后，将结肠内容物与排出的粪便（若有）混合作为 “粪便” 样本。所有样本称重后，加入 1mL PBS 匀浆，在 1100×g 条件下离心 30 秒。收集上清液进行系列稀释，并涂布在 VBM 琼脂平板上用于 CFU 计数。对于估计的 founding population sizes（N_s），取 250μL 器官样本以及 250μL 接种物（26 个技术重复）涂布在 150mm 直径的 VBM 平板上。用于 CFU 和 N_s测定的平板在 37℃下过夜培养后进行菌落计数。图 5 中的 CFU 计数和 N_s值是在 250μL（匀浆组织体积的 1/4）样本中测定得到的。