基于高通量测序技术的PPV抗性诱导研究：四种发夹结构在烟草中的RNAi机制解析

编辑推荐：为应对李痘病毒(PPV)对核果类作物的毁灭性威胁，Erciyes大学团队通过农杆菌介导转化技术，构建了靶向PPV-T毒株UTR/P1、HC-Pro、HC-Pro/P3和CP基因区的四种发夹RNA(ihpRNA)载体，首次结合小RNA高通量测序(HTS)技术揭示了UTR/P1和CP结构能高效产生siRNA并显著抑制病毒积累，为核果类作物抗病育种提供了关键靶点选择依据。

　　在全球核果类作物产业中，李痘病毒(Plum pox virus, PPV)引发的"沙卡病"堪称植物界的"癌症"，每年造成高达100%的果实脱落率。这种由蚜虫传播的病毒自20世纪初在保加利亚首次报道后，已肆虐除澳大利亚外的所有大陆。传统防治措施收效甚微，而检疫制度在多国的失效更凸显了基因工程解决方案的紧迫性。面对这一挑战，土耳其Erciyes大学基因组与干细胞研究中心的Maryam Ghaderi Sohi团队独辟蹊径，利用土耳其本土流行的PPV-T毒株KyEsAp301，开展了一项突破性的RNA干扰(RNAi)抗病毒研究。

研究团队采用Gateway克隆技术构建了四种ihpRNA载体，分别靶向PPV基因组的UTR/P1(752bp)、HC-Pro(649bp)、HC-Pro/P3(594bp)和CP(990bp)区域。通过农杆菌介导转化本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，获得10-11个独立转基因株系。关键技术包括：1)高通量测序分析野生型与转基因植株的siRNA/miRNA表达谱；2)三重病毒挑战实验(PPV-D/M/T毒株)；3)DAS-ELISA病毒检测；4)RT-PCR靶向验证；5)circos图谱展示siRNA分布特征。

研究结果揭示：

1. 抗性评估：UTR/P1和CP构建的转基因株系对三种PPV毒株均表现完全抗性，而HC-Pro组仅8-1株系对PPV-D有部分抗性。RT-PCR证实UTR/P1和HC-Pro/P3组完全无病毒积累。

2. siRNA特征：感染野生型植株中22-nt siRNA占主导(153,839条)，均匀分布于全基因组；而抗性株系中21-nt siRNA富集于靶向区域，UTR/P1和CP组siRNA产量分别达5,261和5,205条，显著高于HC-Pro组的2,971条。

3. miRNA调控：鉴定出770个miRNA(含460个新型miRNA)，其中miR169h-5p在转基因植株中上调8.42倍。GO分析显示病毒感染主要影响碳水化合物代谢和质体功能相关基因。

4. 热点验证：Circos图谱首次直观显示siRNA在靶向区域的特异性积累，证实UTR/P1和CP区域具有更强的siRNA生成能力。

这项发表于《Scientific Reports》的研究具有双重突破：首次将HTS技术应用于PPV抗性机制解析，并发现UTR/P1区域虽在前期研究中被推荐，但其与CP区域共同展现最优抗性表现。研究不仅为核果类作物抗病育种提供了精确的靶点选择方案——推荐优先使用UTR/P1和CP区域构建ihpRNA，更建立了病毒-宿主互作中small RNA调控的分子图谱。特别值得注意的是，靶向病毒5'UTR/P1区域能激发广谱抗性，这对应对PPV的高度变异性具有战略意义。该成果为杏、李等木本植物的转基因抗病育种奠定了关键技术基础，未来通过嫁接等技术可将此抗性导入经济树种，为全球核果产业构建可持续的病毒防御体系。