生物惰性热响应水凝胶3D生物打印hMSC-TERT的活力评估与机械响应基因调控研究

编辑推荐：本研究针对3D生物打印过程中细胞活力下降和机械响应基因调控机制不明的问题，系统评估了Pluronic F127与新型POx/POzi水凝胶对hMSC-TERT细胞的短期影响。研究发现两种生物惰性水凝胶虽保持良好流变性能，但打印后24小时细胞活力下降达50%，并首次揭示FOS基因在POx/POzi中的特异性上调机制，为血管化仿生支架和骨再生应用提供了重要理论依据。

　　

在组织工程和再生医学领域，3D生物打印技术正以前所未有的方式重塑着人工组织的构建范式。这项技术通过将活细胞精确沉积到水凝胶基质中，创造出具有复杂结构的生物构造体。然而，在这一激动人心的技术背后，隐藏着一个关键科学问题：打印过程中的剪切应力和生物物理化学相互作用如何影响细胞的生存和功能？特别是对于具有多向分化潜能的人间充质干细胞(hMSC)，其活力维持和命运调控直接决定了打印组织的最终功能。

维尔茨堡大学的研究团队在《Scientific Reports》发表了一项突破性研究，系统评估了两种热响应性水凝胶——商业化的Pluronic F127和新型聚(2-甲基-2-恶唑啉)-嵌段-聚(2-正丙基-2-恶嗪)(POx/POzi)在3D打印中对永生化人间充质干细胞(hMSC-TERT)的短期影响。研究不仅揭示了细胞活力随时间变化的规律，更首次阐明了机械响应基因FOS和PTGS2在不同水凝胶环境中的差异化调控机制，为优化生物打印参数和设计新型生物墨水提供了重要理论支撑。

关键技术方法包括：采用振幅扫描和频率扫描进行流变学表征；使用22G和30G针头进行挤出式3D打印；通过钙黄绿素AM/碘化丙啶双染和AI辅助图像分析评估细胞活力；采用qPCR技术检测FOS、PTGS2等机械响应基因表达；使用CellTiter-Glo和Caspase-Glo 3/7试剂盒检测细胞活力和凋亡。研究样本为永生化人间充质干细胞系hMSC-TERT。

流变学表征结果显示，含5×10⁶ cells/mL的细胞负载生物墨水与无细胞水凝胶表现出相似的流变行为。Pluronic的储能模量G'普遍高于POx/POzi，证实其形成更坚固的凝胶结构。值得注意的是，高细胞密度并未显著改变生物墨水的粘度特性，这一发现为高细胞密度打印提供了理论依据。

打印过程优化实验揭示了POx/POzi的特殊挑战。与Pluronic相比，POx/POzi需要更精细的参数调控——将网格尺寸扩大至24×24 mm、打印速度提升至300 mm/min、压力精确控制在7-8 kPa才能获得清晰结构。细胞形态学观察发现，打印后细胞出现暂时性伸长，但24小时后均恢复圆形，表明细胞无法在水凝胶中实现正常贴附和伸展。

细胞活力分析呈现令人警觉的趋势。尽管初始混合后细胞活力保持在90%，但打印过程使Pluronic组的活力降至55-80%，而POx/POzi组受影响较小。更值得注意的是，24小时培养后所有组别活力均下降40-50%，研究者将这一现象归因于失巢凋亡(anoikis)和营养缺乏的双重作用。凋亡检测显示，Pluronic组细胞凋亡率更高，提示不同水凝胶可能激活了不同的细胞死亡通路。

机械响应基因表达谱揭示了更复杂的调控机制。在未打印的"Mix"对照组中，FOS表达呈现时间依赖性变化——POx/POzi组在30分钟时显著上调，2小时后恢复基线；而Pluronic组则在2小时达到峰值。PTGS2在所有"Mix"组中持续高表达，暗示炎症反应可能主导其调控。特别值得注意的是，打印过程仅在POx/POzi组中引起FOS的显著上调(22G喷嘴2小时和4小时，30G针头4小时)，而Pluronic组未见此效应。这一发现首次揭示了水凝胶化学成分对机械应力信号传导的差异化调控能力。

分化标志物检测显示，短期培养未引起明显的成骨或软骨分化倾向，表明剪切应力引发的基因变化尚未足以驱动细胞命运改变。这为生物打印构造体的短期应用提供了安全性依据。

研究结论部分强调了三项关键发现：首先，POx/POzi展现出优于Pluronic的细胞相容性，是极具潜力的替代性生物墨水；其次，水凝胶环境(而非打印剪切应力)是影响机械响应基因表达的主要因素；第三，短期培养不会引发非预期分化，但长期培养需要解决失巢凋亡问题。这些发现为设计血管化仿生支架和骨再生材料提供了重要指导。

讨论部分深入剖析了结果的理论意义和应用前景。研究者指出，POx/POzi的温和打印特性和更优细胞相容性使其特别适合作为牺牲材料或细胞递送载体。FOS在POx/POzi中的特异性上调可能被巧妙应用于骨再生场景，通过机械刺激促进成骨分化。未来研究可通过引入RGD粘附序列、与海藻酸盐共混或添加纳米粘土(如Laponite XLG)来增强POx/POzi的长期稳定性，这将大大拓展其在组织工程中的应用范围。

这项研究不仅系统评估了一种新型水凝胶的生物相容性，更深入揭示了3D生物打印中细胞-材料相互作用的分子机制，为再生医学领域的生物墨水设计和优化提供了宝贵的理论依据和实践指导。