70%乙醇优于GTC-TCEP：结核分枝杆菌RNA保存新策略及其在分子诊断中的潜力

本刊推荐：针对结核分枝杆菌RNA易降解难题，研究者系统比较了70%乙醇与GTC-TCEP的保存效果。通过热休克、冻融循环及长期存储实验证实，70%乙醇能稳定转录组图谱，在-20℃维持RNA完整性达12个月，且成本更低、更易获取，为资源有限地区的分子诊断提供新方案。

　　

结核病和麻风病等分枝杆菌感染仍是全球重大公共卫生挑战，而传统培养法耗时漫长——结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)需数周生长，麻风分枝杆菌(M. leprae)甚至无法体外培养。分子检测技术如基于RNA的分子细菌负荷检测(Molecular Bacterial Load Assay, MBLA)和分子活力检测(Molecular Viability Assay, MVA)为快速评估病原体活力和药物反应提供了新思路，但这些技术的成功实施面临一个根本性障碍：RNA分子的极端不稳定性。现有标准保存液如含硫氰酸胍(Guanidinium thiocyanate, GTC)的缓冲体系虽能灭活RNase，但存在成本高、冷链依赖性强等问题，在资源有限地区应用受限。

比利时热带医学研究所等机构的研究团队在《Scientific Reports》发表研究，系统评估了70%乙醇这种廉价易得的替代方案对结核分枝杆菌H37Ra菌株RNA的保存效能。通过模拟临床样本可能经历的热应激、反复冻融及不同温度长期储存等真实场景，发现70%乙醇不仅表现出优于GTC-TCEP（含三(2-羧乙基)膦的GTC缓冲液）的RNA保护能力，还具备简化样本处理流程的独特优势。该研究为改善结核病分子诊断的可及性提供了重要技术支撑。

研究采用三大关键技术方法：1) 热休克实验（45℃处理20分钟）评估转录组即时稳定效果；2) 五种冻融方案模拟冷链中断场景；3) 长达12个月的四梯度温度（-80℃、-20℃、4℃、30℃）保存实验。通过Qubit RNA定量、RNA完整性指数(RIN)分析和靶向qPCR（检测hsp65、sigA等基因），系统比较两种保存液的性能差异。

在热休克实验中，70%乙醇与GTC-TCEP均能有效阻止热应激诱导的hsp65、sigA和16S rRNA表达变化，证实二者均可实现转录组"快照"固定。基线比较显示，乙醇处理样本的RNA回收量显著高于GTC-TCEP（2.4倍，p=0.05），且所有检测的mRNA靶标（esxA、icl等）拷贝数均更高，这对低菌量样本分析尤为重要。

长期储存实验揭示了温度依赖的RNA降解规律。70%乙醇中，-20℃保存的样本在12个月内维持RIN>7.0（RNA测序推荐阈值），而4℃储存时该窗口缩短至3个月。值得注意的是，乙醇样本在30℃过夜储存后仍保持高RIN值（7.6±0.1），显著优于GTC-TCEP组的快速降解。通过计算各温度下转录本与-80℃对照的比值发现，乙醇保存的样本呈现一致的时温依赖性降解模式，而GTC-TCEP组则出现靶标间差异，提示乙醇可能提供更均衡的RNA保护。

冻融稳定性测试中，经历三次冻融循环的乙醇处理样本仍保持稳定RNA产量和RIN值（6.0-7.0），暗示乙醇可能通过抑制冰晶形成发挥冷冻保护作用。相比之下，GTC-TCEP组因RIN检测失败难以评估，进一步凸显乙醇的可靠性。

讨论部分强调，70%乙醇的多重优势使其成为极具转化潜力的保存方案：成本仅为GTC方案的十分之一；无需严格冷链即可维持RNA质量；符合国际航空运输协会(IATA)对危险品的宽松运输要求。尽管在临床样本（如痰液）中的应用仍需验证，但既往研究显示70%乙醇能在1小时内灭活结核分枝杆菌，兼顾生物安全与分子分析需求。

该研究突破性地证明，在-20℃条件下，70%乙醇可实现结核分枝杆菌RNA的年度保存，且耐受多次冻融。这一发现不仅简化了研究样本的管理流程，更对资源有限地区开展结核病分子诊断具有重要实践意义。未来研究需在临床样本和强毒株中验证该方案的普适性，但其成本效益和操作简便性已展现出改变结核病诊断格局的潜力。