肠杆菌常见抗原翻转酶 WzxE：大肠杆菌应对多重环境压力的关键 “卫士” 及其潜在应用价值

本文聚焦大肠杆菌（Escherichia coli），发现敲除翻转酶 wzxE 会使大肠杆菌对酸性、低温和高盐环境敏感。研究表明，脂质连接的肠杆菌共同抗原（ECA）重复单元在依赖于荚膜酸（colanic acid）的情况下影响大肠杆菌抗逆性，WzxE 可抑制其负面影响，为预防食物中毒提供新思路。

　　### 研究背景
大肠杆菌（Escherichia coli）引发的食源性疾病是一个重要的公共卫生问题。据 WHO 数据，2010 年有 35000 人死于肠致病性大肠杆菌引起的肠道疾病。在食物生长和加工过程中，大肠杆菌易受酸性、低温和干燥等多种压力，因此了解其应对这些压力的机制至关重要。

大肠杆菌通过在细胞表面覆盖多糖来抵抗压力，其中荚膜酸（colanic acid）和肠杆菌共同抗原（ECA）是许多大肠杆菌菌株产生的细胞表面多糖。荚膜酸在酸性、低温、高盐和干燥等条件下合成增强，对大肠杆菌抵抗这些压力很重要；而 ECA 由重复的三糖单元构成，在细胞表面有多种存在形式，但其生理作用尚不完全清楚。两者都通过 Wzx/Wzy 依赖的途径合成和分泌，其中 WzxE 负责将 Und-PP 连接的 ECA 三糖重复单元转运过内膜。本研究旨在探究 ECA 合成相关基因缺陷菌株对酸性条件的敏感性，以明确 ECA 的生理作用。

实验结果

1. wzxE 敲除菌株对酸性生长培养基敏感：研究人员对比了野生型和 ECA 合成基因敲除突变体在不同 pH 值 LB 培养基中的生长情况，发现 wzxE 敲除突变体在 pH 5.5 的 LB 培养基中增殖能力明显低于野生型，在 pH 7.0 和 pH 8.5 时则无显著差异。将携带 wzxE 基因的质粒导入突变体后，其在 pH 5.5 时的增殖能力恢复到野生型水平，表明 wzxE 对大肠杆菌在酸性条件下的生长至关重要。
2. wzxE 敲除菌株对酸性商业蔬菜汁敏感：由于植物环境通常呈酸性，研究人员测试了 wzxE 敲除突变体在 V8 培养基（pH 5.6）中的生长情况，发现其增殖能力和菌落形成单位（CFUs）均低于野生型。当 V8 培养基 pH 升高到 7.0 时，突变体的生长和 CFUs 不再受影响，说明 wzxE 敲除突变体对 V8 条件的敏感性与 pH 相关。
3. wzxE 敲除菌株对粗制蔬菜提取物敏感：研究人员进一步检测了 wzxE 敲除突变体对樱桃番茄、胡萝卜、芹菜、生菜和菠菜等粗制蔬菜提取物的敏感性，发现突变体在这些提取物中的活菌数显著低于野生型，且在 pH 较低的樱桃番茄提取物中活菌数下降更明显。导入 wzxE 基因的质粒可恢复突变体在蔬菜提取物中的活菌数，表明 wzxE 敲除突变体对粗制蔬菜提取物敏感。
4. Und-PP 连接的 ECA 重复影响 wzxE 敲除菌株对酸性条件的敏感性：由于 Und-PP 连接的 ECA 重复单元积累会导致大肠杆菌细胞死亡，研究人员推测其与 wzxE 敲除突变体对酸性条件的敏感性有关。通过构建 wzxE 和 wecF 双敲除菌株（wecF 敲除可消除 Und-PP 连接的 ECA 重复单元），发现双敲除菌株在低 pH 的 LB 或 V8 培养基中增殖能力高于 wzxE 单敲除突变体，在 V8 琼脂上的 CFU 计数也与野生型无显著差异，说明 Und-PP 连接的 ECA 重复参与了 wzxE 敲除菌株对酸性条件的敏感性过程。
5. wzxE 敲除菌株在酸性条件下的细胞活力低于野生型：为探究 wzxE 敲除细胞在酸性条件下生长缓慢的原因，研究人员用膜不渗透的碘化丙啶（propidium iodide）对细胞进行染色，通过流式细胞术检测死细胞比例。结果显示，在酸性生长条件（pH 5.5 的 LB 培养基）下，wzxE 敲除突变体的死细胞数量显著高于野生型，且每 OD₆₀₀的 CFUs 更低。额外敲除 wecF 可消除这种差异，表明 wzxE 敲除菌株在酸性生长条件下活力降低是由于积累的 Und-PP 连接的 ECA 重复单元所致。
6. wzxE 敲除对酸性条件的敏感性依赖于荚膜酸生物合成，且可被过表达的 wzxC 拯救：研究人员发现，wzxE 敲除突变体在酸性条件下 wecF 表达没有显著增强。由于 WzxC 和 WzxB 可翻转 Und-PP 连接的 ECA 重复单元，且酸性环境会诱导荚膜酸合成，研究人员推测酸性条件下荚膜酸合成增加会使 WzxC 被 Und-PP 连接的荚膜酸重复单元占据，导致 WzxC 翻转 Und-PP 连接的 ECA 重复单元减少，进而使 wzxE 敲除突变体对酸性条件敏感。实验结果显示，wzxE wcaJ 双敲除菌株（wcaJ 是启动 Und-PP 连接的荚膜酸重复单元生物合成的关键酶）在酸性 LB 培养基中死细胞数量没有显著增加；过表达 wzxC 可恢复 wzxE 突变体在 pH 5.5 时的生长，表明脂质连接的荚膜酸重复单元合成是 wzxE 缺陷导致酸性条件敏感性的必要条件，且过表达 WzxC 可通过防止 Und-PP 连接的 ECA 重复单元致命积累来拯救 wzxE 突变体。
7. wzxE 敲除菌株对低温和高盐条件敏感：荚膜酸生物合成在酸性、低温和高盐条件下被诱导，研究人员检测了 wzxE 敲除突变体在这些条件下的敏感性。结果显示，在 19°C（低温胁迫）和 300 mM NaCl（高盐胁迫）处理后，wzxE 敲除突变体的死细胞数量显著增加，而 wzxE wcaJ 双敲除菌株则没有显著变化，表明 wzxE 敲除突变体对低温和高盐胁迫的敏感性依赖于荚膜酸合成。
8. wzxC 敲除菌株对酸性条件不敏感：为探究除 Und-PP 连接的 ECA 重复单元外，其他 Und-PP 连接的重复糖单元积累是否会增加大肠杆菌对酸性条件的敏感性，研究人员检测了 wzxC 敲除突变体（积累 Und-PP 连接的荚膜酸重复单元）对酸性条件的敏感性。结果显示，wzxC 敲除突变体在 pH 5.5 和 pH 7.0 的 LB 培养基中均表现出生长缺陷，但这与酸性条件敏感性无关，说明积累的 Und-PP 连接的荚膜酸重复单元不会诱导大肠杆菌对酸性条件敏感，而是导致与 pH 无关的生长缺陷。

讨论

本研究首次证明，敲除 Und-PP 连接的 ECA 重复单元翻转酶 wzxE 会使大肠杆菌对酸性、低温和高盐胁迫敏感，且这些胁迫敏感性分别依赖于 ECA 和荚膜酸重复单元构建酶 wecF 和 wcaJ。研究人员推测，在酸性、低温和高盐条件下，wzxE 敲除突变体中荚膜酸产量增加，占据 WzxC，减少了 WzxC 翻转的 Und-PP 连接的 ECA 重复单元数量，导致其致命积累。未来需要量化 wzxE 敲除突变体中 Und-PP 连接的 ECA 重复单元和荚膜酸的含量来验证这一假设。

此外，wzxC 敲除突变体和 wecG、wecF 敲除突变体对酸性条件不敏感，表明 Und-PP 连接的 ECA 重复单元在酸性条件下可能具有特殊毒性，或其积累量在酸性条件下高于其他重复单元。wzxE 敲除突变体积累的 Und-PP 连接的 ECA 可能会影响肽聚糖合成所需的脂质载体，导致细胞形态异常和细胞裂解，但具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

本研究使用的大肠杆菌 BW25113 菌株不表达 O 抗原，而 O 抗原翻转酶 wzxB 可翻转 Und-PP 连接的 ECA 重复单元，因此 wzxE 缺陷的表型可能会因 O 抗原表达和血清型的不同而改变。O 抗原携带菌株在食源性疾病中具有重要意义，后续需要研究本研究的机制是否适用于表达 O 抗原的菌株。

在 V8 培养基和粗制蔬菜提取物实验中，发现除 pH 和渗透压外，蔬菜中的其他因素（如有机酸）可能会放大 wzxE 敲除突变体的表型。wzxE 敲除突变体对多种环境压力和蔬菜提取物更为敏感，且 WzxE 在哺乳动物中不存在，在肠杆菌科中广泛分布且高度保守。因此，开发针对 WzxE 的抑制剂有望成为预防食物中毒的新策略，阻断细菌在植物和人类之间的传播循环。