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推荐阅读：本文聚焦隐球菌性脑膜炎，探究 CD146 在新型隐球菌（C. neoformans）黏附和感染脑微血管内皮细胞（BMECs）中的作用。研究发现，C. neoformans感染会降低 BMECs 上 CD146 表达，CD146 虽影响真菌体外黏附，但在体内对脑感染影响不大，为相关研究提供新思路。
新型隐球菌降低脑内皮细胞中 CD146 的表达
新型隐球菌性脑膜炎是一种常见且难治的中枢神经系统（CNS）感染疾病，死亡率和致残率高。新型隐球菌（C. neoformans）要侵入中枢神经系统，需先黏附并突破血脑屏障（BBB）。CD146 是一种在脑微血管内皮细胞（BMECs）表面表达的黏附分子，本研究旨在探究其在隐球菌血管黏附和血脑屏障侵袭中的作用。
研究人员先分离培养了脑微血管原代内皮细胞，通过免疫荧光染色鉴定了血管内皮细胞表面标记 CD31。用C. neoformans菌株 H99 感染 24 小时后，原代脑内皮细胞的 CD146 表达显著降低。同样，给小鼠静脉注射 H99 细胞 24 小时后，小鼠脑血管系统中感染区域的 CD146 蛋白水平也明显下降。对小鼠脑内皮细胞系 bEnd.3 进行不同时间的 H99 感染实验，发现随着感染时间增加，CD146 表达逐渐降低，且感染 24 小时后，通过流式细胞术检测，CD146 的平均荧光强度和 CD146?细胞数量均减少。这一系列实验表明，CD146 在感染C. neoformans的脑内皮细胞中显著降低，可能参与了隐球菌的血管黏附和感染过程。
新型隐球菌通过 MMP-9 从脑内皮细胞上切割 CD146
微血管内皮细胞上 CD146 的脱落与基质金属蛋白酶（MMPs）的合成有关，且金属蛋白酶的分泌有助于C. neoformans侵入中枢神经系统。研究人员推测C. neoformans可能通过金属蛋白酶从内皮细胞上切割 CD146 蛋白，尤其关注 MMP-3 和 MMP-9。对 bEnd.3 细胞进行 H99 细胞刺激 24 小时后，通过蛋白质免疫印迹法检测发现，细胞培养上清液中 MMP-9 的分泌增加，而 MMP-3 的表达没有明显变化。使用广谱 MMP 蛋白酶抑制剂 BB-94 和特异性 MMP-9 蛋白酶抑制剂 MMP-9-IN-1 处理后，发现这两种抑制剂都能挽救由隐球菌诱导的脑内皮细胞中 CD146 蛋白表达的降低。这表明C. neoformans至少部分通过感染的内皮细胞分泌的 MMP-9 从血管内皮上切割 CD146。
CD146 促进新型隐球菌黏附到脑内皮细胞
为探究 CD146 是否参与C. neoformans对脑内皮细胞的黏附，研究人员在 bEnd.3 细胞中过表达 CD146，通过蛋白质免疫印迹法和免疫荧光法证实了 CD146 的过表达。结果发现，过表达 CD146 后，附着的隐球菌数量显著增加，通过菌落形成单位（CFU）测定发现黏附的隐球菌活力也增强了，荧光显微镜也直观地观察到表达 tdTomato 的隐球菌附着数量增多。相反，脑内皮细胞中 CD146 缺失则会降低C. neoformans的黏附。这些数据表明，CD146 可能促进隐球菌黏附到脑血管上。
CD146 缺失对新型隐球菌脑感染并非必需
为研究 CD146 缺失是否影响真菌侵入中枢神经系统，研究人员给野生型（WT）和 CD146 基因敲除（CD146-KO）小鼠静脉注射低剂量（5×10?）或高剂量（20×10?）的C. neoformans菌株 H99 。感染 24 小时后，评估小鼠脑中的 CFU 数量，发现 CD146-KO 小鼠脑内的真菌载量与 WT 小鼠相比没有显著差异。通过免疫荧光染色检测注射后困在脑实质中的酵母数量，也未发现明显变化。这说明与体外实验中 CD146 介导真菌黏附到脑内皮细胞的结果不同，在体内，CD146 缺失并不影响隐球菌对脑的侵袭或脑内真菌载量。
阻断 CD146 未能治疗新型隐球菌感染
鉴于 CD146 缺失似乎不影响真菌侵入脑，且 CD146 除作为黏附分子外，还能调节血管周细胞的分化和发育，维持血脑屏障的完整性，CD146 缺失会损害血脑屏障的完整性，可能促进真菌穿越血脑屏障和脑感染。研究人员推测阻断 CD146 可能会减少隐球菌对脑血管的黏附。于是在感染前 30 分钟给小鼠腹腔注射 CD146 中和抗体 AA98，对照组注射等量的同型 IgG，然后给小鼠静脉注射 10×10?的C. neoformans菌株 H99 。感染 24 小时后，检测脑、肺和脾脏中的真菌载量，结果显示对照组和 CD146 中和治疗组的脑或肺组织中的 CFU 数量没有显著差异，但 CD146 中和治疗组的脾脏真菌载量逐渐增加。比较脑和脾脏中真菌载量的比值，发现 AA98 阻断 CD146 后，减少了C. neoformans从脾脏到脑的侵袭。然而，AA98 未能延长感染C. neoformans小鼠的存活时间。总体而言，CD146 在C. neoformans脑感染中可能并非必需。
讨论
隐球菌性脑膜炎是由C. neoformans引起的致命疾病，是全球范围内与艾滋病相关的第二大死亡原因。本研究揭示了隐球菌感染后 BMECs 中 CD146 表达降低，可能是由于金属蛋白酶的切割。虽然 CD146 在体外介导了C. neoformans对脑内皮细胞的黏附，但敲除 CD146 或用中和抗体 AA98 阻断 CD146，对C. neoformans脑感染似乎并无明显影响。
作为内皮细胞上的黏附分子，CD146 可以结合多种配体，参与多种病毒、细菌和真菌感染性疾病。本研究表明 CD146 对体外C. neoformans黏附到脑内皮细胞至关重要，但在体内实验中，CD146 敲除小鼠的隐球菌血管黏附并未减少，脑内真菌载量也无明显变化。这可能是因为 CD146 缺失虽降低了隐球菌对血管内皮的黏附，但同时增加了血管内皮的通透性，使游离的隐球菌更容易穿越受损的血脑屏障进入脑实质。此外，CD146 缺失还可能导致中性粒细胞招募减少，而血管内C. neoformans的清除依赖于中性粒细胞的杀伤活性，最终使得 CD146-KO 小鼠和 WT 小鼠脑实质中的真菌载量相当。
使用中和抗体 AA98 治疗隐球菌脑感染时，发现 AA98 增加了脾脏 CFU，提示其可能增加菌血症，但对脑和肺组织中的真菌载量没有影响，也未能延长感染小鼠的存活时间。这表明 CD146 可能介导游离C. neoformans对脑血管内皮的早期附着，但在C. neoformans致病过程中的作用可能并非不可或缺。
本研究也存在一定局限性。扫描电子显微镜证据显示，C. neoformans分泌的金属蛋白酶可能导致真菌 - 内皮细胞界面的微绒毛样结构发生广泛改变，这可能涉及 CD146 蛋白的微妙变化，且C. neoformans可能利用切割后的 CD146 更好地黏附血管。此外，本研究仅关注了内皮细胞中的 CD146，巨噬细胞和其他免疫细胞中的 CD146 在C. neoformans脑传播中的作用值得进一步研究。未来针对 CD146 与C. neoformans相互作用的特异性干预研究，可能有助于攻克脑隐球菌病。
