幽门螺杆菌 Cag IV 型分泌系统物种特异性组分的探秘及其在胃病防治中的关键意义

本文聚焦幽门螺杆菌（H. pylori），运用多种生化方法，发现 CagW、CagL、CagI 和 CagH 与 Cag IV 型分泌系统（T4SS）外膜核心复合物（OMCC）相关且为 T4SS 活性所必需，这为理解幽门螺杆菌致病机制提供新视角，极具科研价值。

　　### 引言
幽门螺杆菌（H. pylori）是一种革兰氏阴性螺旋形细菌，约半数世界人口的胃黏膜受其定植。多数感染者无症状，但少数会发展为消化性溃疡或胃癌，它也是胃癌的主要风险因素，被世界卫生组织列为 I 类致癌物。幽门螺杆菌菌株的特性会影响胃癌发病风险，其中携带cag致病岛（PAI）的菌株与胃癌高发显著相关。

cag PAI 编码 Cag IV 型分泌系统（T4SS）以及效应蛋白 CagA。CagA 经 Cag T4SS 转运到胃上皮细胞，引发与致癌相关的细胞改变，同时该系统还能转运非蛋白质底物，激活或抑制细胞信号传导。

典型的 T4SS 包含 12 种蛋白，多数定位于内膜复合物（IMC）和外膜核心复合物（OMCC）。H. pylori的 Cag T4SS 属于 “扩展型” T4SS，至少 17 种由cag PAI 编码的蛋白参与其活动。已知的 Cag T4SS OMCC 和 IMC 的每个组分对 CagA 的转运都至关重要，此外还有其他 Cag 蛋白和非 Cag 蛋白也参与其中，但部分蛋白的作用机制尚不明确。

结果

1. 以 HA-CagF 为诱饵分离 Cag 蛋白：研究人员改进免疫纯化方案，以 HA-CagF 为诱饵，利用质谱检测，发现多种额外的 Cag 蛋白（如 Cag1、Cagβ 等）与已知的 OMCC 组分一同被分离出来。通过与对照菌株（HP0179-HA 和 HP0838-HA）比较，证实 CagW、CagN 等 9 种 Cag 蛋白的分离与 HA-CagF 免疫纯化显著相关。SAINTexpress 分析进一步确认了这一结果，同时还发现一些非 Cag 蛋白在 HA-CagF 菌株中也有较高水平的分离。此外，研究人员还对不同菌株进行免疫纯化实验，结果表明以 HA-CagF 为靶点的免疫纯化在分离 OMCC 组分方面更有效。
2. HA-CagF 免疫纯化中 Cag 蛋白的富集：通过对未处理裂解物和免疫纯化洗脱液进行配对质谱分析，发现除了预期的 CagF、CagA 和 5 种 OMCC 组分外，还有 8 种 Cag 蛋白在免疫纯化样品中显著富集，其中包括 CagW、CagN 等。
3. CagW、CagL、CagI 和 CagH 与 OMCC 相关联：利用尺寸排阻色谱法对 HA-CagF 免疫纯化分离的蛋白进行分级，结果显示 OMCC 蛋白存在于高分子质量组分中，CagA 和 CagF 则在较低分子质量组分中。质谱分析表明，CagW、CagL、CagI 和 CagH 主要与 OMCC 蛋白在相同的高分子质量组分中被检测到，说明它们与 OMCC 相关联。
4. CagW、CagL、CagI 和 CagH 的分离依赖于 OMCC 的存在：分析缺乏 OMCC 组装能力的菌株（HA-CagF ΔcagX）和无法用 HA-CagF 分离 OMCC 组分的菌株（HA-CagF ΔcagA），发现 CagW、CagL、CagI 和 CagH 不能从这些菌株中分离出来。而在产生不完整 OMCC 的突变菌株（HA-CagF Δcag3和 HA-CagF ΔcagM）中，这些蛋白仍能被检测到，表明外膜帽的组装并非这些蛋白与 OMCC 相互作用所必需。
5. CagW、CagL、CagI 和 CagH 对 OMCC 组装并非必需：构建并分析cagL、cagI、cagH缺失突变株和 ΔcagW突变株，发现这些突变株无法诱导 AGS 胃上皮细胞产生 IL-8，表明它们影响 Cag T4SS 的活性。但通过负染电子显微镜（NS-EM）分析和质谱分析发现，这些蛋白缺失并不影响 OMCC 的组装，说明它们与 OMCC 相关联但并非 OMCC 组装所必需。

讨论

本研究通过多种生化方法确定 CagW、CagL、CagI 和 CagH 与 Cag T4SS OMCC 相关且为其活性所必需，但未发现 Cag T4SS IMC 的已知组分以及一些先前报道的非 Cag 蛋白。

CagW、CagL、CagI 和 CagH 与 HA-CagF 共纯化，在 HA-CagF 免疫纯化洗脱液中相对丰度更高，且与 OMCC 共洗脱。它们虽对 Cag T4SS 活性至关重要，但不参与 OMCC 组装。其在 Cag T4SS OMCC 中的拷贝数可能较少，或者在纯化过程中部分丢失，导致检测到的光谱计数相对较低。

除上述 4 种蛋白外，CagN 和 CagG 也可能与 OMCC 相关，但由于光谱计数低，对它们的评估受限。其他 Cag 蛋白在免疫纯化中的表现各异，部分与 HA-CagF 或对照蛋白共纯化情况相似，部分未被检测到或未被有效纯化。

研究还发现一些非 Cag 蛋白与 HA-CagF 免疫纯化相关，但它们在 Cag T4SS 活性中的功能尚不明确。

先前研究对 CagW 和 CagL 与其他物种中 VirB6 和 VirB5 的同源性存在争议，本研究未检测到它们之间的序列相关性。CagL、CagI 和 CagH 之间存在相互作用，CagI 可能在促进其他 3 种蛋白与 OMCC 的相互作用中起重要作用。

目前对 Cag T4SS 的整体结构仍不完全了解，CagW、CagL、CagI 和 CagH 可能是周质亚组件（如菌毛或拱）的结构成分，也可能在细菌表面与 OMCC 相互作用，未来需进一步明确它们与 OMCC 的关联方式及其对 Cag T4SS 活性的贡献机制。

材料和方法

1. H. pylori生长条件：H. pylori菌株在含 5% 羊血的胰酶大豆琼脂平板上，37°C、5% CO₂环境下培养，液体培养使用不含亚硫酸盐的布鲁氏菌肉汤并添加 10% 热灭活胎牛血清。
2. H. pylori菌株构建：采用多种方法构建不同的H. pylori菌株，如利用反选择方法构建 ΔcagW菌株，通过质粒介导将编码 HA 标签和目的基因的序列导入ureAB染色体位点构建表达 HA 标记蛋白的菌株等。
3. H. pylori蛋白的免疫纯化：对先前的免疫纯化方法进行改进，包括调整细菌培养体积、裂解条件和免疫纯化条件等。细菌裂解后，用与蛋白 G Dynabeads 非共价连接的单克隆抗 HA 抗体孵育，再用含 HA 肽的缓冲液洗脱目标蛋白。
4. 质谱分析：对免疫纯化样品进行胰蛋白酶消化，生成的肽段经 S-Trap 处理后进行质谱分析。采用不同的数据采集模式（如 DDA-PASEF 和 diaPASEF），并使用相应的软件（如 FragPipe、Scaffold 和 Spectronaut）对数据进行处理、过滤和可视化。
5. CagA 转位实验：将 AGS 胃上皮细胞与H. pylori共培养，裂解细胞后进行蛋白质定量，通过 SDS-PAGE 分离蛋白并转移到硝酸纤维素膜上，用抗磷酸酪氨酸单克隆抗体或抗 CagA 多克隆抗血清进行免疫印迹检测。
6. 尺寸排阻色谱法：将 HA-CagF 免疫纯化的洗脱液稀释后，通过 Superose 6 10 × 300 mm 柱进行分离，收集不同组分并储存于 -20°C。
7. 蛋白质免疫印迹分析：将免疫纯化的蛋白进行 SDS-PAGE 分离，转移到硝酸纤维素膜上，用抗H. pylori Cag 蛋白的兔多克隆抗血清进行免疫印迹，通过增强化学发光法检测免疫反应条带。
8. IL-8 诱导实验：将 AGS 细胞接种于 96 孔板，与H. pylori共培养后收集上清液，使用人 CXCL8 酶联免疫吸附试验定量检测 IL-8 含量。
9. 负染电子显微镜分析：将样品滴加到覆有碳膜的铜网上，经水洗、染色后，在电子显微镜下观察成像。