丝状噬菌体 M13 对肠道上皮细胞的影响：炎症反应与细菌感染的新机制

本文研究发现丝状噬菌体（如 M13 和 Fd）能直接刺激人肠道上皮 HT-29 细胞产生促炎反应，M13 还可降低细菌内化。这为揭示噬菌体与肠道黏膜的复杂相互作用提供了新视角，对理解疾病发病机制有重要意义。

　　### 丝状噬菌体 M13 诱导肠道上皮细胞的促炎反应
人类肠道病毒组包含多种病毒，其中噬菌体是肠道病毒组的主要成分。在多种疾病状态下，肠道病毒组会发生改变，且已证实疾病状态下的肠道病毒组能引发促炎反应，影响肠道内稳态。然而，噬菌体对人类肠道上皮细胞的直接刺激作用尚未得到充分研究。丝状噬菌体（如 M13 和 Fd）可感染细菌并影响哺乳动物免疫，但它们对肠道上皮细胞的影响有待探究。本研究旨在考察肠道上皮 HT-29 细胞对裂解性噬菌体 T4、?X174 以及丝状噬菌体 M13、Fd 的黏膜和功能反应。

材料和方法

1. 细菌菌株和噬菌体库存：本研究使用的噬菌体及其宿主细菌菌株来自德国微生物和细胞培养物收藏中心。细菌在 1% Luria Bertani（LB）琼脂平板上培养，用于后续实验。
2. 噬菌体滴度测定：采用双层琼脂覆盖法测定噬菌体滴度，通过计数平板上的噬菌斑数量来确定噬菌体浓度。
3. 噬菌体纯化：结合 Phage-on-Tap 协议和聚乙二醇沉淀法纯化噬菌体，并用 Limulus 变形细胞溶解物（LAL）测试检测内毒素含量，确保实验中噬菌体的纯度。
4. 细胞培养：人肠道细胞系 HT-29 在添加特定成分的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，在 CO₂培养箱中生长，实验前进行血清饥饿处理。
5. RNA 分离和 cDNA 合成：用 TRIzol 试剂提取 HT-29 细胞的总 RNA，经纯度和浓度测定后，使用 Superscript III 逆转录酶进行逆转录合成 cDNA。
6. 实时逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）：使用 StepOnePlus 热循环仪和特定引物进行 RT-qPCR，以甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，采用 ΔΔCt 法分析基因表达变化。
7. 活力 / 细胞毒性测定：用 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells 检测细胞凋亡，通过流式细胞仪分析活细胞和死细胞数量。
8. 细胞因子微球检测（CBA）：使用 CBA Human Inflammatory Cytokine Kit 检测 IL-8 细胞因子的释放，按试剂盒说明书操作并分析数据。
9. 庆大霉素保护试验：通过庆大霉素保护试验测定肠道上皮细胞对细菌的内化作用，对实验结果进行统计分析。
10. 统计分析：所有实验至少重复三次，数据以平均值 ± 标准误差（±SEM）表示，使用 GraphPad PRISM 软件进行统计分析，P < 0.05 认为具有统计学意义。

结果

1. 噬菌体诱导上皮细胞的促炎细胞因子激活：研究发现，不同噬菌体对 HT-29 细胞中 IL-8 表达的影响不同。丝状噬菌体 M13 在各时间点诱导的 IL-8 表达均显著高于其他噬菌体，且在非预处理细胞中也能诱导较高的 IL-8 表达和分泌。此外，M13 还能诱导更高的促炎细胞因子肿瘤坏死因子 α（TNFα）表达，且细胞活力未受显著影响。而 Fd 对 IL-8 表达和分泌的影响较小，且其诱导的 IL-8 表达呈浓度依赖性。裂解性噬菌体 T4 和 ?X174 在 6 h 时诱导的 IL-8 和 TNFα 表达显著高于脂多糖（LPS）及噬菌体与 LPS 的组合，且能抑制 LPS 诱导的 IL-8 激活。
2. 丝状噬菌体 M13 刺激肠道上皮细胞可减少细菌内化：实验表明，M13 能显著减少大肠杆菌 W1485 被 HT-29 细胞内化的数量，且这种减少作用在与 LPS 共刺激时依然存在。然而，丝状噬菌体 Fd 预处理 HT-29 细胞后，并未观察到细菌内化数量的减少，说明 M13 和 Fd 对细菌内化的影响存在差异，且细菌内化具有菌株依赖性。
3. 噬菌体 M13 刺激引发抗病毒的 I 型和 III 型干扰素反应：M13 刺激 HT-29 细胞后，显著诱导了 I 型干扰素 β（IFNβ）和 III 型干扰素 λ（IFNλ）的表达，在 6 h 时 IFNβ 和 IFNλ 表达明显升高，但 I 型干扰素 α（IFNα）表达无显著变化。而 Fd 刺激 HT-29 细胞后，IFNα、IFNβ 和 IFNλ 的表达在 6 h 和 24 h 均无显著变化，表明丝状噬菌体在肠道上皮细胞中引发的抗病毒反应存在差异。
4. 丝状噬菌体 M13 增强丁酸盐介导的 LL-37 抗菌肽表达：单独使用 M13 或 Fd 处理 HT-29 细胞，均未显著上调抗菌肽 cathelicidin LL-37 和 β - 防御素 - 1（hβD - 1）的表达。短链脂肪酸（SCFAs）中的丁酸盐可显著上调 LL-37 和 hβD - 1 的表达，当 M13 与丁酸盐联合使用时，能显著增强 LL-37 的表达，但对 hβD - 1 表达无显著影响。Fd 与丁酸盐联合使用，对 LL-37 和 hβD - 1 表达均无显著影响，说明特定噬菌体可与肠道代谢物协同诱导抗菌肽基因表达。

讨论

上皮细胞是肠道防御的第一道防线，噬菌体在肠道微生物群中含量丰富，且在多种炎症性疾病中其丰度发生改变。本研究证实噬菌体可直接刺激肠道上皮细胞产生促炎反应，且丝状噬菌体 M13 诱导的 IL-8 激活作用更强，这种激活作用与是否预处理细胞无关。此外，裂解性噬菌体与丝状噬菌体在与 LPS 的协同作用方面存在差异，裂解性噬菌体可降低 LPS 诱导的炎症反应，其机制可能与噬菌体和 LPS 的物理相互作用有关。

在细菌内化方面，M13 可减少大肠杆菌 W1485 被 HT-29 细胞内化，但不能确定其是否能保护细胞免受细菌入侵，后续需用肠道病原体进行研究。M13 和 Fd 对细菌内化的影响不同，可能与它们的衣壳蛋白结构或氨基酸组成差异有关。

M13 诱导的抗病毒 I 型和 III 型 IFN 表达可能在调节细菌内化中发挥作用，但也可能存在导致细菌清除受损的情况。进一步对丝状噬菌体刺激的肠道上皮细胞进行全局转录组分析，有助于明确抗病毒反应基因和细胞识别噬菌体的机制。

此外，M13 抑制细菌内化的机制可能与黏膜表面成分有关，如 MUC2 等。M13 可能通过与黏膜表面相互作用或进入细胞内来调节细菌内化，未来研究可通过去除黏液层或考察细胞内机制来进一步探究。

总之，本研究表明噬菌体对人类肠道上皮细胞有直接影响，在细菌感染中可能发挥重要作用，为理解噬菌体与肠道黏膜的相互作用及疾病发病机制提供了新线索。