尿石素 A 通过调控 AKT-FOXO1介导的自噬抑制结核分枝杆菌胞内生存：潜在的结核病新疗法

《Effect of urolithin A on intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis by regulating AKT-FOXO1-mediated autophagy》一文发现，尿石素 A（UroA）可显著抑制巨噬细胞和小鼠体内结核分枝杆菌（Mtb）生长，通过 AKT-FOXO1通路促进自噬，还能与一线抗结核药协同作用，或可用于宿主导向疗法（HDT）。

　　### 研究背景
结核病（Tuberculosis，TB）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，是全球人类发病和死亡的主要原因之一。2022 年，超 1000 万人受 TB 影响，约 130 万人因 TB 死亡。耐药 TB 的流行，如耐利福平 TB，严重威胁公共卫生，开发有效抗 TB 药物至关重要。
宿主导向疗法（Host-directed therapy，HDT）是治疗 TB 尤其是耐药 TB 的新策略，通过小分子调节宿主抗 TB 活性，如伊马替尼可改善巨噬细胞吞噬体酸化促进 Mtb 清除，泼尼松等可缓解 TB 患者免疫病理。自噬是维持细胞稳态的基本过程，也是宿主清除 Mtb 的先天免疫防御机制，许多 HDT 药物可触发自噬发挥杀菌作用。
尿石素 A（Urolithin A，UroA）由肠道微生物对植物来源的鞣花酸生物转化而成，在多种疾病中具有抗氧化、抗炎等有益作用，且无明显不良反应。UroA 可促进线粒体自噬，改善抗肿瘤免疫等，但 UroA 对 Mtb 的作用及机制尚不明确。

研究结果

1. UroA 抑制巨噬细胞内 Mtb 生长：通过细胞活力测定，确定 UroA 在 Mtb 感染的 THP-1 细胞中 50% 抑制浓度为 149.5 μM，本研究选用≤90 μM 的 UroA 进行后续研究。菌落形成单位（CFUs）实验表明，UroA 能显著降低 THP-1 细胞和骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）内 Mtb 的存活，且呈剂量依赖性。但 UroA 对 Mtb 的最低抑菌浓度 > 1.2 mM，说明其可能通过增强巨噬细胞功能来促进宿主对 Mtb 的清除。
2. UroA 增强 Mtb 感染巨噬细胞的自噬通量：在 Mtb 感染的 THP-1 细胞和 BMDMs 中，UroA 处理后，脂质结合的轻链 3B（LC3B）-II 从 LC3B-I 的转化显著增强，p62 水平明显改变，透射电镜观察到自噬空泡增多，且 UroA 不影响铁死亡和细胞凋亡。用自噬抑制剂 NH₄Cl 处理后，UroA 处理的 Mtb 感染细胞中 LC3B-II 和 p62 积累进一步增加，表明 UroA 激活了自噬通量。
3. UroA 通过促进自噬降低 Mtb 在体内外的生存：利用 mRFP-GFP-LC3B 报告基因 THP-1 细胞，发现 UroA 处理增加了自噬体和自噬溶酶体的点状形成，增强了异源自噬，表现为 Mtb 与 p62、LC3B 的共定位增加。用 NH₄Cl 预处理 Mtb 感染的巨噬细胞，UroA 的抗结核作用显著受损。在 Mtb 感染小鼠模型中，UroA 给药可降低肺部细菌负荷，但自噬抑制剂巴氟霉素 A1（BafA1）可抵消这一作用，表明 UroA 诱导的自噬通量增加有助于清除细胞内 Mtb。
4. UroA 介导的自噬与蛋白激酶 B（AKT）活性密切相关：用自噬体形成抑制剂 3 - 甲基腺嘌呤（3-MA）处理 THP-1 细胞和 BMDMs，发现 UroA 诱导的 LC3B-II 和 p62 增加被显著抑制，提示 UroA 在自噬体形成上游激活自噬。UroA 预处理的未感染或 Mtb 感染的 THP-1 细胞中，磷酸化 AKT（p-AKT）水平降低，LC3B-II 水平升高，且 AKT 蛋白水平无明显变化，同时 p-mTOR、p-AMPK 及其蛋白水平无显著差异，表明 UroA 通过抑制 AKT 激活自噬。
5. AKT 激动剂抑制 UroA 介导的自噬和抗结核作用：使用 AKT 激动剂 SC79，发现其可逆转 UroA 对 AKT 磷酸化的抑制和 LC3B-II 的增加，减少 UroA 诱导的自噬体和自噬溶酶体点状形成，且 3-MA 和 SC79 预处理显著降低 UroA 的抗结核作用，进一步证明 UroA 通过抑制 AKT 激活及其活性诱导自噬发挥抗结核作用。
6. UroA 通过调节 AKT - 叉头盒蛋白 O1（FOXO₁）信号激活自噬：对 Mtb 感染的 THP-1 细胞进行 RNA 测序（RNA-seq）分析，发现 UroA 处理后，与磷脂酰肌醇 - 3 - 激酶（PI3K）-AKT 信号通路相关基因显著差异表达，其中 FOXO₁表达上调。定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹分析表明，UroA 预处理的巨噬细胞中 FOXO₁表达增加，p-AKT 和 p-FOXO₁水平降低，LC3B-II 水平升高。RNA-seq 数据和 qRT-PCR 验证还显示，UroA 处理的 Mtb 感染巨噬细胞中，FOXO₁调节的自噬相关基因 Sestrin-3（SESN3）和 Beclin-1（BECN1）转录显著上调，表明 UroA 通过靶向 AKT-FOXO₁信号诱导自噬。
7. AKT-FOXO₁信号调节的 UroA 激活自噬发挥抗结核作用：使用 FOXO₁特异性抑制剂 AS1842856（AS），发现其显著降低 UroA 诱导的 Mtb 感染 THP-1 细胞和 BMDMs 中 LC3B-II 表达，减少自噬体和自噬溶酶体点状形成，降低 UroA 的抗结核作用，说明 UroA 通过调节 AKT-FOXO₁介导的自噬抑制细胞内 Mtb 生长。
8. 异烟肼（INH）与 UroA 联合治疗协同促进 Mtb 清除：INH 与 UroA 联合治疗显著限制了 THP-1 细胞和 BMDMs 内 Mtb H37Rv 的生长，且 UroA 单独或与 INH 联合使用均可显著抑制临床耐 INH 的 Mtb（C2）生长，表明 UroA 可作为一线抗结核药物的辅助治疗药物，用于治疗 TB 尤其是耐药 TB。

研究讨论

UroA 通过调节 AKT-FOXO₁信号通路诱导自噬，有效抑制 Mtb H37Rv 和临床耐 INH 的 Mtb 在细胞内的生长。UroA 诱导的自噬与多种宿主保护功能相关，AKT 信号在 UroA 诱导的自噬中起关键作用。UroA 通过降低 AKT 磷酸化和活性，减少 FOXO₁磷酸化，使其转位到细胞核发挥转录活性，上调 SESN3 和 BECN1 等自噬相关基因的表达，促进自噬，从而发挥抗结核作用。
UroA 口服安全性良好，在临床和治疗中可安全使用。HDT 与抗结核药物联合是治疗耐药 TB 的有效手段，许多天然化合物如黄连素、胡椒碱等在 HDT 中展现出良好潜力，UroA 与 INH 联合使用抗菌效果优于 INH 单独使用，表明 UroA 可作为 HDT 药物用于 TB 辅助治疗。