细菌效应蛋白在宿主 - 微生物相互作用中的角色
细菌感染对全球公共卫生构成重大挑战，随着抗生素耐药性的增加，深入了解感染过程对于制定治疗和预防策略至关重要。细菌病原体进化出多种策略来与宿主相互作用并建立感染，其中细菌毒力蛋白起着关键作用，而效应蛋白（effector proteins）是一类在感染过程中发挥重要功能的分泌蛋白。
在感染过程中，效应蛋白通过介导宿主 - 病原体蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPIs），操纵宿主细胞功能，以利于病原体的生存、复制和传播 。例如，细胞内病原体鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）编码两种 III 型分泌系统（T3SS），分别位于致病岛 SPI - 1 和 SPI - 2 上 。SPI - 1 T3SS 在细菌被摄取前控制效应蛋白的表达，介导细菌内化进入非吞噬性宿主细胞；SPI - 2 T3SS 在细菌进入宿主细胞后，在含有沙门氏菌的液泡（SCVs）中表达，分泌的效应蛋白有助于维持细胞内生存环境，阻碍溶酶体运输，促进细菌在细胞内的存活和复制。
除了在感染中的作用，效应蛋白还参与自然界中多种共生关系。比如，土壤中的根瘤菌（Rhizobia）通过效应蛋白在宿主豆科植物的根瘤中发挥作用，促进氮固定；维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）利用效应蛋白与宿主水蛭建立互利共生关系。
细菌效应蛋白的特性与作用机制
细菌效应蛋白通过多种分泌系统转运到宿主细胞内，目前已知有十一种不同的分泌系统，如 T1SS - T11SS 。其中，T1SS、T3SS、T4SS 和 T6SS 可直接将蛋白质输送到靶细胞，而其他分泌系统则依赖 Sec 和 Tat 途径等。效应蛋白的分泌在感染过程中通常受到严格调控，且分泌后能在宿主细胞内精确定位，许多效应蛋白擅长在宿主细胞的生物膜上发挥功能。研究表明，约 30% 的效应蛋白会定位于宿主细胞膜 。
在分子水平上，效应蛋白进化出多种作用机制来靶向宿主细胞过程。部分效应蛋白通过结构和 / 或功能模拟宿主蛋白来发挥作用，如鼠伤寒沙门氏菌的 SopE 和 SopE2，它们功能上模拟宿主 Rho 鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs），激活 Rho 家族 GTPases，促进细菌摄取进入非吞噬性宿主细胞。
细菌效应蛋白还常与其他效应蛋白协同作用，共同靶向宿主的某一信号通路，以克服宿主的免疫反应。例如，福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）分泌的 OspG、OspI 和 IpaH9.8 等效应蛋白，虽靶向不同的宿主蛋白，但都能抑制 NF - κB 通路，从而逃避宿主的免疫防御。
许多细菌效应蛋白具有针对宿主靶点的酶活性，导致宿主 - 病原体相互作用往往是短暂的。如嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）的效应蛋白 VipD，具有磷脂酶 A1活性，可去除内体膜上的磷脂酰肌醇 - 3 - 磷酸（PI (3) P），影响其脂质组成，防止与含有军团菌的液泡（LCV）融合，促进细菌在细胞内的存活和复制。
此外，不少效应蛋白具有多功能性，含有不同的结构域来介导独特的生物学功能。例如，嗜肺军团菌的效应蛋白 DrrA，其 C 末端的 PI (4) P 结合位点可促进蛋白锚定在 PI (4) P 阳性的 LCV 膜上，中央结构域作为 GEF 激活宿主 GTPase Rab1，N 末端结构域具有腺苷酸转移酶活性，可修饰 Rab1，干扰其内源 GAP。
鉴定细菌效应蛋白 - 宿主靶点的挑战
过去二十年，基于质谱（MS）的蛋白质组学结合亲和纯化（AP）方法，能够灵敏地检测蛋白质 - 蛋白质相互作用 。在鉴定细菌效应蛋白的宿主靶点时，靶向亲和纯化 - 质谱（AP - MS）是常用的传统技术之一。然而，细菌效应蛋白与宿主蛋白相互作用的动态和短暂性质，使得在鉴定宿主靶点时面临诸多挑战。亲和纯化要求蛋白质 - 蛋白质相互作用在整个实验过程中保持完整，而许多这样的相互作用难以通过该方法检测到。此外，标准实验方案中的长时间孵育和洗涤步骤可能会限制弱相互作用的保留。虽然化学交联法可尝试保留弱相互作用，但存在蛋白质聚集、假阳性以及数据可能无法准确反映相互作用丰度等问题。
由于大量效应蛋白定位于宿主细胞的生物膜上，膜相关蛋白的溶解也是一个难题。因为溶解膜相关蛋白所需的剧烈裂解方法通常与标准 AP - MS 方法不兼容，这会影响对细菌效应蛋白和宿主蛋白相互作用组的映射。而且，基于亲和复合物纯化的方法还存在假阳性的问题，传统方法在非生理条件下鉴定相互作用，可能会导致一些在体内不相互作用的蛋白在细胞裂解后发生人为的相互作用。
酵母双杂交筛选也是一种常用的工具，该方法通过在酵母中表达效应蛋白基因和宿主 cDNA 文库来检测蛋白质 - 蛋白质相互作用 。然而，这种方法存在内在的挑战，它依赖于在酵母中的表达，而目标蛋白在非天然宿主中必须保持正确折叠，并且 cDNA 文库在更原始的宿主中的表达可能会影响其功能，导致在哺乳动物中可能无法鉴定出相应的宿主靶点。
邻近依赖性标记技术：研究蛋白质 - 蛋白质相互作用的新工具
邻近依赖性标记技术是一种在真核细胞中鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用的重要技术，它依赖于一种酶，该酶能在生理条件下对相互作用和附近的蛋白质进行共价标记，生成目标蛋白的邻近蛋白组（proxisome） 。目标蛋白与该酶重组表达为融合蛋白，细胞裂解后，基于化学修饰对标记的蛋白质进行亲和纯化，随后通过 MS 进行检测。
该技术在检测细菌 - 宿主蛋白质 - 蛋白质相互作用方面具有一定优势。由于标记迅速，适合捕获弱或短暂的相互作用；不可逆的标记方式使得该方法能够采用更剧烈的裂解策略，以溶解膜相关蛋白；而且该方法在活细胞中进行标记，适合鉴定体内相互作用。
目前已开发出多种基于酶标记的策略用于鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用，其中生物素连接酶依赖性标记和基于过氧化物酶的标记是主要的方法。基于过氧化物酶的技术如辣根过氧化物酶 C（HRP）或工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX）具有很高的时间分辨率，但标记所需的反应底物可能对活细胞有毒性 。本文主要关注生物素连接酶介导的酶促标记，即邻近依赖性生物素识别（BioID）技术。
邻近依赖性生物素识别（BioID）技术
BioID 技术最初用于鉴定哺乳动物细胞内的内源性蛋白质 - 蛋白质相互作用和蛋白质邻近蛋白组，它使用具有 promiscuous 底物特异性的生物素连接酶，将附近蛋白质的赖氨酸残基标记上生物素 。最初的版本使用大肠杆菌生物素连接酶 BirA 的变体 BirA*，BirA在其活性位点有一个突变（R118G），降低了对 5’AMP 的亲和力，使得反应性生物素酰 - 5′ - AMP 能够非特异性地对附近蛋白质进行生物素化 。在最初描述的方法中，将携带感兴趣的诱饵基因与生物素连接酶（birA）融合的质粒在添加过量生物素的培养基中培养的哺乳动物细胞中瞬时表达，然后通过链霉亲和素亲和纯化提取生物素化的蛋白质，并进行 MS 分析。BirA * 为单体（35 kDa），能够研究空间特异性相互作用（约 10 nm），其标记时间通常在 15 - 24 小时，但也有在 1 小时内完成标记的记录。
近年来，开发出了多种具有不同标记特性的生物素连接酶用于 BioID 技术（见表 1）。BioID2 源自嗜热自养甲烷杆菌（Aquifex aeolicus），其 R40G 突变赋予了增强的 promiscuous 生物素化能力。BioID2 缺乏大的 DNA 结合结构域，尺寸较小（27 kDa），可能能够改善融合蛋白的亚细胞定位。与 BirA相比，BioID2 需要的生物素更少，生物素化活性更高，标记时间与 BirA相当（15 - 24 小时）。
TurboID 和 miniTurbo 源自 BirA*，旨在缩短标记时间，它们能够在 10 分钟到 3 小时内有效标记 。MiniTurbo 尺寸较小（28 kDa），可能对蛋白质靶向和功能的干扰较小，而 TurboID（35 kDa）与 BioID（35 kDa）大小相似。
AirID 基于祖先 BirA 酶开发，具有较高的邻近标记活性，最短标记时间为 1 小时，活性相对 TurboID 和 miniTurbo 较低，但毒性明显更低，适合用于体内研究。
最近，有研究开发出一系列快速标记的生物素连接酶。MicroID2 是 BioID2 的截短版本，缺乏 C 末端结构域，在生物素结合结构域有一系列突变，在短标记时间（10 分钟到 1 小时）内表现出比 BioID2 和 miniTurbo 更强的生物素化活性，生物素化水平接近 TurboID，但背景标记较高，为此开发了 lbMicroID2，降低了背景标记但活性也有所降低 。UltraID 也是源自 BioID2 的截短变体，是目前最小的生物素连接酶之一（19.7 kDa），比 BioID2 和 miniTurbo 小约 25% 。UltraID 在 10 分钟内的生物素化水平接近 TurboID，且背景标记比 TurboID 少。
这些生物素连接酶衍生物各自具有独特的优势，为蛋白质组学研究提供了有价值的工具。
BioID 在宿主 - 病原体相互作用研究中的应用
为了探究 BioID 在研究细菌效应蛋白 - 宿主蛋白质 - 蛋白质相互作用中的潜在适用性，D’Costa 等人对 BioID 和传统的 AP - MS 方法进行了平行比较 。选择了一组五个已知宿主相互作用体且具有可用于功能验证表型的鼠伤寒沙门氏菌效应蛋白进行研究。构建了一系列表达质粒，将每个效应蛋白基因与 birA * 融合，并稳定表达在人上皮细胞中，通过 BioID 和抗 Flag AP - MS 进行平行分析。
BioID 分析鉴定出八个已知的宿主 - 病原体相互作用，而 AP - MS 分析仅检测到两个已知相互作用。并且，BioID 检测到的已知宿主 - 病原体相互作用与 AP - MS 鉴定的不同，表明这两种方法可作为互补工具用于细菌发病机制的研究。此外，BioID 还揭示了鼠伤寒沙门氏菌效应蛋白的新候选宿主相互作用体，在五个效应蛋白中鉴定出与 381 个宿主蛋白的候选相互作用，包括一些先前已知在鼠伤寒沙门氏菌感染中起作用，但与效应蛋白的相互作用未被证实的宿主蛋白或蛋白复合物。
进一步研究发现，效应蛋白 SifA 与宿主复合物 BLOC - 2（溶酶体相关细胞器复合物 2）的相互作用是通过 BioID 独家鉴定出来的，且该相互作用对于感染期间 SCV 在宿主细胞内的定位和稳定性至关重要，证明 BLOC - 2 是 SifA 的一个新宿主靶点。总体而言，这项研究表明 BioID 有望作为一种互补工具，用于鉴定细菌效应蛋白的候选宿主靶点。
真核细胞质膜是重要的信号转导界面，与细胞免疫密切相关 。许多细菌效应蛋白靶向质膜以颠覆宿主免疫系统，促进细菌存活，但由于质膜中整合膜蛋白丰度低、溶解性差，研究起来颇具难度。BioID 已被证明能够成功鉴定质膜和细胞内膜上的内源性蛋白质 - 蛋白质相互作用，在研究宿主 - 病原体相互作用方面具有潜力。
Mojica 等人利用 BioID 技术对鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）的新型效应蛋白 SINC 进行了表征，SINC 定位于宿主核膜 。将编码 SINC 的基因与 birA * 和 Myc 标签融合构建哺乳动物表达质粒，转染到人胚肾细胞系中稳定表达融合蛋白。添加外源生物素促进生物素化后，对纯化的生物素化蛋白质进行 MS 分析，鉴定出 50 个候选宿主结合伙伴，其中大部分是核膜蛋白，随后的免疫沉淀实验证实了与核膜蛋白 Emerin 的相互作用。
Conlan 等人在烟草相关宿主植物本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中开发了一个系统，将编码靶向植物细胞质膜的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）效应蛋白 AvrPto 的基因与 birA * 融合，并在本氏烟草叶片组织中表达 。BioID 分析揭示了一个先前报道的相互作用以及四个参与免疫功能的新候选相互作用体。其中，APK1 和 TOM1 两个候选相互作用体相互作用，当它们的基因表达被沉默时，丁香假单胞菌的生长受到抑制。
Khan 等人将 BioID 应用于整个植物系统，利用模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana），构建了条件表达与 BirA * 和 HA 标签融合的膜靶向丁香假单胞菌效应蛋白 HopF2 的转基因植物 。通过该系统，基因表达受地塞米松诱导型启动子控制。BioID 鉴定出 19 个独特的膜相关宿主蛋白，包括至少十个已知的 HopF2 宿主相互作用体以及参与免疫的新候选相互作用体。
对于许多细菌病原体而言，黏附到宿主细胞并随后入侵是感染生命周期中的关键步骤，宿主细胞膜表面受体是细胞外细菌效应蛋白的重要靶点。Jiang 等人利用 BioID 识别膜蛋白的固有能力，研究猪链球菌（Streptococcus suis）分泌的毒力蛋白猪溶血素（SLY） 。构建编码 SLY 与 TurboID 和 His 标签融合的细菌表达质粒，在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白，将纯化的蛋白外源添加到人内皮细胞中，孵育促进与宿主细胞表面结合后，添加外源生物素促进标记。后续 BioID 分析鉴定出 251 个与 SLY - TurboID 特异性相关的蛋白质，其中六个表面膜蛋白 ARF6、GRK6、EPB41L5、DSC1、TJP2 和 PNN 被确定为候选宿主相互作用体。通过共免疫沉淀证实了 SLY 与 ARF6 和 PNN 之间的宿主 - 病原体蛋白质 - 蛋白质相互作用，进一步研究发现 ARF6 促进了 SLY 诱导的细胞毒性、p38 MAPK 信号通路的激活、细胞凋亡以及 SLY 在小鼠中的毒力。
Ward 等人同样利用 TurboID 研究了分泌的细菌毒力蛋白靶向的宿主细胞表面受体 。艰难梭菌（Clostridioides difficile）毒素 B（TcdB）是感染期间分泌的一种强效细胞毒素，它通过表面受体结合宿主细胞，随后通过内吞作用进入细胞 。在内涵体酸化后，毒素成熟、裂解并释放。TcdB 含有四个功能域：葡萄糖基转移酶域（GTD）、半胱氨酸蛋白酶域（CPD）、递送和受体结合域（DRBD）以及重复寡肽区域（CROP）。
为了研究 TcdB 在宿主细胞表面的作用，Ward 等人使用与 TurboID 融合的 TcdB 受体结合域重组蛋白，在大肠杆菌中表达并纯化。将含有 TcdB 三个受体结合域（CPD、DRBD 和 CROP）的重组蛋白外源添加到人胚肾细胞中，补充外源 ATP、氯化镁和生物素孵育一小时后进行 MS 分析，鉴定出 15 个感兴趣的蛋白质，包括先前已证实为 TcdB 相互作用伙伴的表面受体 LRP1 。此外，对添加到 18Co 细胞中的仅含有 CPD 和 DRBD 域的重组蛋白进行分析，发现了 TcdB 的已知受体 FZD2 以及另外两个独特的候选相互作用体。不同细胞系产生的不同结果凸显了在 BioID 分析中考虑细胞系选择的重要性。
鉴于 TcdB 会转运到宿主细胞内，Ward 等人还利用 BioID 研究了其细胞内宿主靶点 。构建了表达 miniTurbo 与 TcdB 的 GTD 域融合的诱导型稳定细胞系，诱导融合构建体表达过夜，补充生物素一小时后进行 MS 分析，鉴定出 311 个候选靶点，去除与特定细胞区室相关的对照靶点后，最终得到 25 个靶点，其中包括已知的相互作用体 RhoA，RhoA 是一种小 GTPase，在质膜介导细胞骨架动力学，有助于细胞间黏附和运动。这项研究进一步展示了 BioID 作为细胞外和细胞内探针的多功能性，以及其在研究膜结合蛋白，尤其是表面蛋白方面的适用性。
Jorgenson 等人的研究则展示了 BioID 在研究宿主对感染反应方面的应用 。他们没有分析细菌蛋白的宿主相互作用体，而是研究了衣原体感染期间，宿主 SNARE 蛋白 VAMP4 和 Stx10 在含有细菌的液泡上的动态变化。通过对 BirA* - SNARE 融合蛋白捕获的蛋白质网络分析，发现了两个宿主蛋白 Stx10 和囊泡相关膜蛋白相关蛋白（VAPB）之间的新相互作用，更好地理解了 VAMP4 在衣原体感染后的蛋白质网络变化。
总体而言，这些研究不仅展示了 BioID 在研究细菌效应蛋白 - 宿主蛋白质 - 蛋白质相互作用方面的潜力，还凸显了其检测膜相关宿主蛋白的优势，而<
