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在生物流体代谢组学研究中，质谱（MS）和核磁共振（NMR）虽互补却很少联用。为解决联用难题，研究人员开发血清样本制备方案。结果显示，该方案可行且能减少样本量、扩大代谢组覆盖范围，对代谢组学研究意义重大。
在生命科学研究的广袤领域中，代谢组学宛如一颗璀璨的新星，正逐渐照亮人们探索生物奥秘的道路。它专注于检测、识别和量化生物样本中的小分子，就像一位敏锐的侦探，通过追踪这些小分子的踪迹，揭示生物体的生化状态以及对内外因素的响应。在众多生物样本里，血液和尿液这类全身性生物流体备受关注，其中血清更是疾病诊断的 “黄金标准”，它能精准地反映内源性血液代谢组的组成。
质谱（MS）和核磁共振（NMR）技术在生物流体代谢组学研究中占据着重要地位。液相色谱 - 质谱联用（LC-MS）凭借高化合物覆盖率和低样本量需求的优势，成为代谢组学研究的主力军，但它也存在诸如易受批次效应影响、化合物特征识别率低等问题。而 NMR 虽然灵敏度相对较低，却能提供高度可重复和定量的分析，还能检测肽、脂蛋白等多种物质。理论上，将两者结合可以显著丰富代谢物的覆盖范围，然而在实际研究中，这种联用的情况却少之又少。
造成这一现象的原因主要在于样本制备方面的难题。NMR 分析需要使用氘代溶剂和缓冲样本，这可能会影响 MS 分析的准确性，比如氘代溶剂可能导致代谢物分子中的酸性氢与氘发生交换，从而改变代谢物的质量，干扰数据处理和代谢物识别；同时，MS 分析通常需要去除蛋白质，而 NMR 中蛋白质信号有可能作为有用的生物标志物，无需去除。这些问题犹如一道道屏障，阻碍了两种技术的联用。
为了打破这些屏障，来自国外的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种能够实现顺序 NMR 和多 LC-MS 非靶向代谢组学分析的血清样本制备方案，旨在利用单个血清等分试样进行多种分析，以提高研究效率并扩大代谢组覆盖范围。
研究人员在实验中运用了多种关键技术方法。样本制备方面，采用商业无菌 AB 型人血清，分别进行 NMR 和 MS 样本的制备，其中 NMR 样本用 75mM 磷酸钠缓冲液（pH7.4）稀释，MS 样本用乙腈（MeCN）提取。分析检测上，运用不同频率的 NMR 光谱仪进行1H NMR 实验，通过特定的脉冲序列获取光谱并处理；采用阴离子交换色谱 - MS（IC-MS）和反相超高效液相色谱 - MS（RPLC-MS）进行代谢物分析，对数据进行预处理和统计分析。
研究结果主要有以下几个方面：
- 氘代溶剂对代谢物的影响：通过对比用 Milli-Q 水和氘代水制备的血清样本的非靶向质谱，研究人员发现超过 98.5% 的化合物特征显示出 1:1 的相关性，几乎没有检测到氘代化合物。这表明使用氘代溶剂进行样本制备不会导致血清代谢物的氘代，消除了人们对氘代溶剂影响代谢物分析的担忧。
- NMR 磷酸盐缓冲液对化合物特征丰度的影响：研究发现，添加 75mM 磷酸盐缓冲液会对代谢组产生一定影响。在 LC-MS 分析中，虽然大部分化合物特征仍保持直接相关，但 IC-MS 和 RPLC-MS 检测到的部分特征丰度发生了显著变化，RPLC-MS 受影响程度更大。不过，在研究覆盖的代谢物范围内，多数代谢物的丰度并未受到明显影响。
- 血清去蛋白对代谢物谱的影响：
- 蛋白质去除对 NMR 谱的影响：研究对比了不同蛋白质去除方法对 NMR 光谱的影响。10kDa MWCO 过滤可改善光谱基线，检测到一些之前被掩盖的低分子质量化合物，但也会导致部分生物有意义的代谢物丢失或信号被干扰，如脂蛋白、N - 乙酰糖蛋白等信号消失，同时引入了甘油信号。乙腈沉淀蛋白质的方法虽然在蛋白质去除效率上稍逊一筹，但 NMR 光谱与 MWCO 过滤后的光谱相似。
- 蛋白质去除对 LC-MS 谱的影响：通过多平台 LC-MS 分析发现，结合乙腈沉淀和 MWCO 过滤的方法对极性代谢组影响较小，但会降低疏水性化合物的提取重现性。在 IC-MS 分析中，仅有少数化合物特征的丰度发生显著变化；而在 RPLC-MS 正离子模式下，较多化合物特征的丰度出现明显增减。
- 样本稀释对血清代谢物谱的影响：研究不同缓冲液浓度对代谢物谱的影响时发现，样本稀释对 RPLC-MS 和 IC-MS 分析结果影响显著，而磷酸盐缓冲液离子浓度主要对 IC-MS 谱有明显影响，对 RPLC-MS 分析影响较小。PCA 分析进一步揭示了样本稀释、缓冲液浓度和 MWCO 过滤等因素对代谢物谱的影响模式。
综合上述研究结果，研究人员提出了两种适用于不同研究目的的工作流程。Workflow 1 适用于仅关注低分子量代谢物或希望保持 NMR 和 LC-MS 样本组成高度相似的研究，需在 NMR 分析前进行蛋白质去除；Workflow 2 则适用于可能从 NMR 对蛋白质和肽的分析中受益的研究，可在 NMR 分析后进行蛋白质去除。
这项研究意义重大。它成功开发了一种高效的血清样本制备方案，使单个临床血清等分试样能够同时用于 NMR 和多 LC-MS 非靶向分析，大大减少了样本体积需求，显著扩大了代谢组覆盖范围。同时，研究全面深入地探讨了样本制备对复杂代谢生物流体谱的影响，有力地证明了 LC-MS 和 NMR 在代谢组学研究中的兼容性和互补性。这一成果为代谢组学研究开辟了新的道路，为疾病机制研究、生物标志物发现以及个性化医学的发展提供了强有力的支持，推动了生命科学和健康医学领域的进一步发展。
