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为解决 circRNA 原位成像技术有限的问题，来自中国的研究人员开展利用催化发夹组装（CHA）介导适配体构象变化检测细胞内外 circRNA 的研究。结果显示该方法在复杂生物系统性能良好，能用于肿瘤细胞 circRNA 成像。这为研究活细胞中 circRNA 相关生理过程提供了新工具。
环状 RNA（circRNA）在所有细胞类型和组织中普遍表达，在调节多种生物过程中发挥关键作用，并与多种人类癌症相关。由于其固有的稳定性，circRNA 在诊断和治疗多种人类疾病，尤其是作为生物标志物方面极具应用前景。在本研究中，研究人员成功设计了一种新型发光 RNA 传感器，利用催化发夹组装（CHA）介导适配体构象变化，用于细胞外和细胞内 circRNA 的检测。CHA 过程由 circRNA 中独特的反向剪接接头（BSJ）特异性触发，能够精确区分环状 RNA 和同源线性 RNA。通过合理设计和修饰 RNA 适配体序列，增强其对 CHA 产物的亲和力，修饰后的 RNA 适配体发生特异性构象变化，便于与小分子染料结合，从而产生明显的荧光信号。该方法在复杂生物系统中表现出强大的性能和稳定性，适用于肿瘤细胞中 circRNA 的可视化以及细胞外 circRNA 的检测。此外，该方法在活细胞成像中展现出良好的生物相容性和极低的细胞毒性，对靶分子具有卓越的特异性和敏感性。这项技术为阐明活细胞中涉及 circRNA 的复杂生理过程提供了有价值的工具。
环状 RNA（circRNA）是一类独特的 RNA 分子，在 40 多年前被发现，它通过反向剪接使线性 RNA 共价结合而产生。作为高度保守的非编码 RNA，circRNA 在所有细胞类型和组织中普遍表达，在调节多种生物过程中发挥关键作用，并且与多种人类癌症的发展有关。从功能上讲，多项研究表明，circRNA 可以作为微小 RNA（miRNA）的海绵、与 RNA 结合蛋白相互作用，甚至作为蛋白质翻译的模板，发挥癌基因或抑癌基因的作用。在各种人体组织中已鉴定出多种 circRNA，它们具有丰度高、稳定性强和组织特异性表达模式等显著特征。肝细胞癌（HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，是癌症相关死亡的第三大原因。circRNA 线粒体 tRNA 翻译优化 1（circMTO1）是一种最近发现的环状 RNA，来源于位于 6q13 染色体上的 MTO1外显子，通常发挥抑癌作用。circMTO1在多种恶性肿瘤中表达异常，包括肝细胞癌、胃癌和结直肠癌，促进肿瘤的发生和发展。circMTO1在肝癌组织中表达下调，可能通过特定的信号通路抑制肝癌的进展。由于 circRNA 的共价闭环结构，它能够抵抗核酸外切酶的降解。这种固有的稳定性促进了 circRNA 在多种人类疾病中的实际应用，包括其作为生物标志物的潜力。因此，量化 circRNA 的表达水平可以为肿瘤诊断和治疗方法提供坚实的基础。
目前，有许多检测 circRNA 的方法。其中，逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仍然是应用最广泛的经典方法。其他技术包括数字 PCR（ddPCR）、Northern 印迹法、NanoString nCounter 分析等。此外，还引入了几种新开发的 circRNA 检测方法，包括基于双链特异性核酸酶和协同 CRISPR-Cas 系统的电化学检测方法、逆转录滚环扩增法、利用表面增强拉曼光谱的双信号生物传感器、用四面体 DNA 纳米结构修饰的微流控芯片传感器以及单分子荧光原位杂交（FISH）。然而，这些方法大多主要集中在 circRNA 的体外或细胞外检测，关于活细胞内 circRNA 原位成像技术的报道有限。为了更好地阐明 circRNA 在肿瘤细胞发展中的机制，研究人员提出了一种新颖的可视化方法，能够检测细胞外和细胞内的 circRNA，从而更全面地了解 circRNA 的功能。
适配体是一类单链 DNA 或 RNA 分子，具有特定的分子识别能力，通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选获得。许多体外筛选已鉴定出能够与弱荧光小分子结合的 RNA 适配体，这些适配体可以将小分子的荧光增强几个数量级。它们还能最大限度地减少背景干扰，实现无标记成像，并且具有分子尺寸小和结构可定制的优点。通过用这些 RNA 适配体对感兴趣的细胞 RNA 进行基因标记，并在细胞可渗透的同源小分子荧光配体中孵育细胞，研究人员可以有效地研究 RNA 的定位。在过去十年中，已经开发出许多用于细胞内 RNA 成像的 RNA 适配体，包括 Spinach、Broccoli、Corn、Mango、Pepper 等。目前的发光 RNA 传感器通常采用分裂或变构设计原理，破坏 RNA 适配体的正确折叠构象，从而产生低背景荧光。只有当 RNA 传感器与靶 RNA 结合时，才会观察到明显的荧光发射差异。在本研究中，研究人员利用适配体构象变化来实现低背景信号，确保 RNA 适配体仅在存在靶标的情况下折叠成正确的构象。
在这项研究中，研究人员展示了一种发光 RNA 传感器，该传感器利用靶标触发的催化发夹组装（CHA）诱导惰性 Pepper 适配体发生正确的构象变化，从而实现对活细胞中 circRNA 的精确原位成像。研究方案设计中使用的 CHA 是一种等温、无酶核酸扩增方法，只需要两个亚稳 DNA 发夹，并且可以自主运行，无需人工干预。CHA 以其设计简单、适应性强和信号转换效率高而闻名，是一种强大的分子生物技术工具，在生物传感和生物成像领域具有广阔的应用前景。有许多生物传感器利用 CHA 检测非编码 RNA（如 miRNA 检测）。通过合理设计和修饰，研究人员将 Pepper 适配体转化为惰性形式，确保在没有特定靶序列的情况下它无法形成正确的构象。CHA 系统专门设计用于识别 circRNA 独特的反向剪接接头（BSJ）。在没有靶 circRNA 的情况下，CHA 保持无活性，惰性 Pepper 适配体保持非活性状态，无法结合 HBC530。当遇到靶 circRNA 时，CHA 被激活，能够持续循环并产生大量 CHA 产物。这些产物促使修饰后的 Pepper 适配体形成与 HBC530 结合所需的正确构象，从而产生强烈的荧光。研究方案中选择的 HBC530 是一种合成染料，类似于绿色荧光蛋白（GFP）荧光团，具有结构刚性的电子受体和强电子供体。HBC 在溶液中不发荧光，但在限制分子内运动时会强烈发荧光，因此当与 Pepper 适配体结合时，HBC 被激活并发出明亮的荧光。此外，研究人员引入了具有良好细胞膜通透性的小分子染料 HBC530。一旦进入细胞，HBC530 与正确折叠的 Pepper 适配体结合后会发出强烈的荧光信号，从而实现对活细胞中 circRNA 的原位成像。鉴于 circRNA 原位成像的报道有限，这种发光 RNA 传感器扩展了发光成像技术的工具库，为阐明活细胞中涉及 circRNA 的复杂生理过程提供了有价值的方法。
实验中使用的 DNA 和 RNA 序列购自中国上海的生工生物工程股份有限公司和上海捷瑞生物工程有限公司。所有序列均列于补充文件中的表 1。核糖核酸酶抑制剂（RiboLock RNase Inhibitor）、核酸外切酶 I（Exonuclease I，Exoi）和核酸外切酶 III（Exonuclease III，Exo III）购自美国赛默飞世尔科技公司。HBC530 购自美国 MedChemexpress（MCE）生物技术公司。T4 DNA 连接酶购自 New。
如方案 1 所示，研究人员成功开发了一种基于催化发夹组装（CHA）技术的发光 RNA 传感器，该传感器能够诱导原本惰性的 Pepper 适配体发生正确的构象变化，随后与小分子染料 HBC530 结合，产生强大的荧光信号，用于活细胞中环状 RNA 的原位成像。研究人员最初通过合理设计和调整茎部结构，将 Pepper 适配体转化为惰性形式。
总之，研究人员开发了一种新型的靶标触发、CHA 介导适配体构象变化的发光 RNA 传感器，用于活细胞中 circRNA 的原位成像。这种方法具有几个显著优点：该传感器能够在体外和活细胞中可视化靶 circRNA。CHA 中的发夹序列专门针对 circRNA 中独特的 BSJ 设计，能够精确识别 circRNA，并将其与其他 RNA 区分开来。
