M2 巨噬细胞来源外泌体通过 TGF-β1RI/Smad2/3 信号通路逆转 TGF-β1诱导的气道上皮细胞间质转化：哮喘气道重塑治疗新希望

为探究 M2 巨噬细胞来源外泌体（M2φ-exos）对 TGF-β1诱导的气道上皮（BEAS-2B）细胞上皮间质转化（EMT）的调控作用及机制，研究人员开展相关研究。结果发现 M2φ-exos 可抑制 BEAS-2B 细胞 EMT，该成果为哮喘气道重塑治疗提供新思路。

　　在人体的呼吸系统中，哮喘就像一个难以捉摸的 “幽灵”，给无数患者带来痛苦。它是一种慢性且高度异质性的炎症性疾病，气道重塑是其重要病理特征，严重影响患者的生活质量和疾病预后。目前，虽然对哮喘的研究不断深入，但气道重塑的机制仍不明确。上皮间质转化（EMT）在哮喘气道重塑中起着关键作用，抑制 EMT 有望成为哮喘治疗的新靶点。巨噬细胞作为免疫细胞的重要成员，其极化状态与哮喘的发生发展密切相关，M2 巨噬细胞具有抗炎作用，可能是哮喘治疗的潜在突破口。外泌体作为细胞间通信的重要媒介，在哮喘相关气道炎症和重塑中的作用逐渐受到关注，但关于 M2 巨噬细胞来源外泌体（M2φ-exos）对哮喘气道上皮细胞 EMT 的影响及机制尚不清楚。在此背景下，中山人民医院、中山口腔医院以及南方医科大学顺德医院的研究人员开展了相关研究，研究成果发表在《European Journal of Medical Research》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过细胞培养技术，将 THP-1 细胞诱导分化为 M2 巨噬细胞，同时培养 BEAS-2B 细胞。接着，采用超速离心法分离和纯化 M2 巨噬细胞分泌的外泌体。然后，利用流式细胞术鉴定 M2 巨噬细胞，通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白质免疫印迹法对分离的外泌体进行表征。此外，运用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹法和免疫荧光染色检测相关基因和蛋白的表达水平。

研究结果如下：

1. M2 巨噬细胞的鉴定：在显微镜下，THP-1 细胞经诱导后形态发生明显变化，变为具有较大、扁平且有刺状突起的 M2 巨噬细胞。通过流式细胞术检测发现，M2 巨噬细胞表面标记 CD206 的阳性表达率显著增加，证实成功诱导出 M2 巨噬细胞。
2. M2φ-exos 的内化：TEM 观察到 M2φ-exos 呈小的球形或杯状囊泡，NTA 显示其峰值粒径在 120 - 130nm，蛋白质免疫印迹法检测到其高表达外泌体标记蛋白 CD81 和 TSG101，而细胞裂解液中未检测到这些标记。将 PKH67 标记的 M2φ-exos 与 BEAS-2B 细胞共培养后，荧光显微镜观察到绿色荧光标记的外泌体分布在细胞胞质中，表明 M2φ-exos 可被 BEAS-2B 细胞有效摄取。
3. M2φ-exos 对 TGF-β₁诱导的 EMT 相关基因表达的影响：与对照组相比，TGF-β₁诱导组的 BEAS-2B 细胞形态发生改变，呈现细长的纺锤形，细胞间连接松散。随着 M2φ-exos 浓度增加，细胞形态逐渐恢复为多边形，细胞间黏附增加。qRT-PCR 结果显示，TGF-β₁诱导组中 Vimentin、Collagen 1 和 Snail 的 mRNA 表达上调，E-cadherin 的 mRNA 表达下调；加入 50μg/mL 或 100μg/mL M2φ-exos 后，Vimentin、Collagen 1 和 Snail 的 mRNA 水平显著降低，E-cadherin 的 mRNA 水平显著升高，且 50μg/mL M2φ-exos 的作用更为明显。
4. GW4869 对 M2φ-exos 保护作用的影响：用 GW4869 预处理 M2 巨噬细胞抑制外泌体释放后，与 M2φ-exos 组相比，细胞变得更松散，细胞间隙增大。蛋白质免疫印迹法和免疫荧光分析结果表明，M2φ-exos 可降低 Vimentin、Collagen 1 和 Snail 的表达，增加 E-cadherin 的表达，而 GW4869 可逆转这些变化，说明 M2φ-exos 可显著抑制 TGF-β₁诱导的 BEAS-2B 细胞形态改变和 EMT。
5. M2φ-exos 对 TGF-β₁诱导的 TGF-β₁RI/Smad 信号通路激活的影响：qRT-PCR 和蛋白质免疫印迹分析显示，与对照组相比，TGF-β₁诱导组的 TGF-β₁RI mRNA 水平升高，Smad7 mRNA 水平降低；M2φ-exos 处理后，TGF-β₁RI mRNA 水平降低，Smad7 水平升高，且 GW4869 可逆转这些变化。蛋白质免疫印迹法还表明，TGF-β₁刺激后，TGF-β₁RI、p-Smad2/Smad2 和 p-Smad3/Smad3 的蛋白水平增加，Smad7 水平降低；加入 M2φ-exos 后，TGF-β₁RI、磷酸化 Smad2 和 Smad3 的水平显著降低，Smad7 水平显著升高，说明 M2φ-exos 通过抑制 TGF-β₁诱导的 TGF-β₁RI/Smad2/3 信号通路激活发挥治疗作用。
6. M2φ-exos 与 SB431542 联合对 TGF-β₁诱导的 EMT 的影响：用 SB431542 预处理 BEAS-2B 细胞后，与 TGF-β₁诱导组相比，E-cadherin 蛋白表达上调，Vimentin 蛋白表达下调。将 M2φ-exos 与 SB431542 联合处理 TGF-β₁刺激的 BEAS-2B 细胞，蛋白质免疫印迹分析显示，与 SB431542 处理组相比，TGF-β₁RI、磷酸化 Smad2 和 Smad3 的表达水平显著降低，间接表明 M2φ-exos 可能通过靶向 TGF-β₁RI/Smad 信号通路及其他潜在机制逆转 TGF-β₁诱导的气道上皮间质转化。

研究结论和讨论部分指出，本研究证实 M2φ-exos 可逆转 TGF-β₁处理的 BEAS-2B 细胞的表型变化，其分子机制可能是通过 TGF-β₁RI/Smad2/3 信号通路实现的。这一发现为哮喘的病理过程提供了新的视角，为 M2φ-exos 在哮喘相关气道重塑中的有益作用奠定了理论基础。然而，该研究也存在一定局限性，如体外模型不能完全模拟体内复杂的病理生理微环境，M2φ-exos 调节 EMT 的具体机制尚未完全阐明。未来研究可进一步探索 M2φ-exos 的具体作用机制，以及其在体内的治疗效果，为哮喘的治疗提供更有效的策略。