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这篇系统综述聚焦口腔癌，全面探讨循环肿瘤 DNA（ctDNA）和游离 DNA（cfDNA）在其中的诊断与预后价值。研究发现，cfDNA 水平升高与不良预后相关，ctDNA 可用于监测癌症进展等，为口腔癌诊疗提供新方向。
引言
口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）作为一种原发性口腔癌，具有极强的侵袭性和局部浸润性，经常发生转移，预后较差，死亡率较高。目前，早期检测 OSCC 仍面临诸多挑战，现有的诊断方法依赖于特定症状和诊断研究，但这些方法并不可靠，导致很多患者在疾病晚期才被确诊，极大地限制了治疗效果。在临床实践中，术后病理分期对患者预后的预测比现有标志物更为准确。
循环肿瘤 DNA（Circulating Tumor DNA，ctDNA）是肿瘤细胞释放到血液中的 DNA 片段，而游离 DNA（Cell-Free DNA，cfDNA）则是在体液中自由循环的肿瘤来源 DNA。癌症患者血液中普遍存在游离循环 DNA（cfDNA），它由肿瘤细胞的凋亡和坏死过程产生，不过在良性疾病患者和健康个体中也会出现。研究人员一直在探索 cfDNA 的数量和质量，将其作为多种肿瘤的潜在生物标志物，这些标志物在癌症的早期检测、微小残留病检测、治疗反应监测、预后预测以及治疗决策指导等方面具有重要意义。
从分子层面来看，游离 DNA 通过正常细胞和肿瘤细胞的凋亡、坏死或主动分泌进入血液，而 ctDNA 是游离 DNA 中来源于肿瘤的部分。ctDNA 携带肿瘤特异性的突变、拷贝数变异和 DNA 甲基化模式，能够反映肿瘤的基因组特征。在口腔鳞状细胞癌中，常见的基因改变包括 TP53 和 PIK3CA 突变，以及 p16 和 RASSF1A 基因的高甲基化。游离 DNA 的定量水平可以反映肿瘤负荷，而 ctDNA 分析有助于早期检测、治疗反应监测和预后预测。然而，由于 ctDNA 在血液中的浓度较低，尤其是在癌症早期，因此需要采用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和下一代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）等高灵敏度技术来进行可靠检测。
对于口腔癌患者，已有研究对 ctDNA 和 cfDNA 进行了探索，用于检测疾病相关突变、评估肿瘤负荷、监测疾病进展以及预测治疗反应。尽管 ctDNA 和 cfDNA 具有巨大的潜力，但它们在口腔癌中的临床应用仍处于发展阶段，需要进一步研究来明确其诊断和预后作用，并规范使用方法。
研究方法
本综述严格遵循系统评价和荟萃分析的首选报告项目（Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses，PRISMA）指南制定研究方案，对研究过程中的任何修改都进行了详细记录。由于所有数据均来自已批准的研究，因此无需伦理审批。在研究实施和报告过程中，分别遵循 Cochrane 手册和 PRISMA 声明的要求。
研究聚焦的核心问题是：循环肿瘤 DNA（ctDNA）和游离肿瘤 DNA（cfDNA）在口腔和头颈部癌症患者的诊断和预后中发挥着怎样的作用？
为全面检索相关研究，在 PubMed、Web of Science、Google Scholar 和 SCOPUS 这四个主要数据库中进行了无限制检索。在 Google Scholar 中，检索了前 200 条结果。使用的检索词为：((((prognosis) OR (diagnosis)) OR (survival)) AND ((((ctDNA) OR (cfDNA)) OR (circulating tumor DNA)) OR (cell-free DNA))) AND (((oral cancer) OR (oral squamous cell carcinoma)) OR (oral malignancy))，对检索到的所有标题和摘要进行仔细筛选和审查。
研究的纳入标准如下：研究以英文撰写；参与者数量超过 20 人；对血液样本中的 ctDNA 进行了测量；基于 Qubit 或 Nanodrop 定量以及聚合酶链反应（PCR）检测 ctDNA；使用 ctDNA 或 cfDNA 作为肿瘤标志物报告口腔癌患者的预后和 / 或诊断。排除标准包括：叙述性综述、人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）阳性的 OSCC（为保证研究人群的同质性，因为 HPV 相关肿瘤具有独特的分子特征，可能影响生物标志物的检测结果）、数据不足的研究、综述、病例报告、荟萃分析以及给编辑的信件。
对从所有数据库检索到的研究进行初步筛选，利用 Excel 电子表格去除重复记录。在去除重复项后，对标题和摘要进行筛选，排除不相关的论文。然后，根据纳入和排除标准对剩余研究的全文进行评估，最终将符合标准的研究纳入定量和定性综合分析。研究选择过程由两位作者独立进行，如有分歧则通过讨论解决。从纳入研究中提取关键信息，包括研究背景、样本量、国家、参与者特征（性别和平均年龄）、评估方法、口腔癌类型、测量结果以及主要发现。使用纽卡斯尔 - 渥太华量表（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）评估纳入研究的偏倚风险，两位作者分别对各项研究的偏倚风险进行独立评估，如有差异则通过讨论解决。NOS 量表包含三个类别标准，最高分为 9 分，得分大于等于 7 分被认为是 “高质量”，2 - 6 分是 “中等质量”，1 分及以下为 “低质量”。
研究结果
通过电子数据库最初检索到 3155 条记录，其中 PubMed、SCOPUS 和 Web of Science 数据库提供了大部分数据，另外从 Google Scholar 补充了 1 条记录。经过严谨的筛选流程，首先去除了 102 条重复记录，将数据集缩小到 3054 条独特记录。接着，通过对标题和摘要的严格评估，依据预先设定的标准排除了 2993 条记录，剩余 61 篇全文进行进一步资格审查。在这 61 篇全文中，1 篇为病例报告，10 篇因结果不符合要求被排除，18 篇涉及不符合条件的研究人群，2 篇分类存在模糊性，1 篇是给编辑的信件，12 篇被归类为综述。最终，经过研究人员的一致认可，17 项符合研究目标的研究被纳入系统综述。
纳入的 17 项研究类型丰富，包括 11 项队列研究、1 项病例系列研究、2 项描述性研究和 3 项病例对照研究。这些研究来自多个国家，如中国台湾、日本、印度、法国、英国、比利时、以色列、美国、波兰、巴西和芬兰，这使得研究结果更具全球代表性。
研究样本量差异较大，参与者数量从最少的 2 人到最多的 390 名口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者不等，部分研究还纳入了头颈部癌患者。在已审查的研究中，9 项报告了参与者的年龄和性别信息，平均年龄范围为 19.39 岁至 65 岁，男性参与者数量从 11 人到 105 人不等，女性参与者数量从 4 人到 160 人不等，性别比例在各研究中有所不同，多数报告性别分布的研究中男性比例高于女性。
研究对象涵盖多种口腔癌类型，9 项聚焦头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC），1 项针对转移性头颈部 HNSCC，1 项研究头颈部癌，6 项围绕口腔鳞状细胞癌（OSCC）展开。研究结果突出了 ctDNA 和 cfDNA 在口腔癌或头颈部癌患者预后和诊断方面的重要作用。大部分研究在 2018 年之后开展。
综合研究结果表明，循环肿瘤 DNA（ctDNA）和游离 DNA（cfDNA）作为生物标志物在评估头颈部癌症，特别是口腔鳞状细胞癌（OSCC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）方面具有重要价值。cfDNA 水平升高与肿瘤大小、不良预后、淋巴结转移以及疾病晚期密切相关。此外，ctDNA 和 cfDNA 在监测癌症进展、治疗反应、复发风险、转移以及总体生存方面具有潜在的预测作用。ctDNA 检测与区域转移、无进展生存期较差以及某些侵袭性肿瘤模式（如高风险的侵袭模式和深部侵袭）相关，显示出其在了解肿瘤行为和指导治疗策略方面的强大潜力。虽然部分研究发现较高的 ctDNA 水平与高代谢肿瘤负荷呈正相关，但也有研究未能明确 ctDNA 与总体生存之间的联系。在使用纽卡斯尔 - 渥太华量表（NOS）评估的 12 项研究中，8 项被判定为高质量，4 项为中等质量。
讨论
本系统综述全面评估了循环肿瘤 DNA（ctDNA）和游离 DNA（cfDNA）作为口腔和头颈部癌症生物标志物的作用。通过细致的筛选过程，确定了 17 项符合标准的研究，这些研究为深入了解 ctDNA 和 cfDNA 在这些恶性肿瘤中的预后和诊断潜力提供了宝贵信息。
纳入研究在设计、样本量、方法学和测量结果等方面存在显著差异。大多数研究属于观察性研究，其中以回顾性队列研究居多。研究的地理分布广泛，来自不同国家的研究丰富了研究数据，增强了研究结果的普遍性，凸显了该主题在全球范围内的重要性。
研究结果表明，ctDNA 和 cfDNA 在评估头颈部癌症方面具有潜在的应用价值，尤其是在口腔鳞状细胞癌（OSCC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中。cfDNA 水平升高一直与不良预后、较大肿瘤尺寸、淋巴结转移和晚期疾病阶段相关。此外，ctDNA 和 cfDNA 在监测癌症进展、治疗反应、复发风险、转移和总体生存方面显示出良好的前景。
从已审查的研究中得出了几个关键发现。首先，ctDNA 检测与某些临床病理特征相关，如年龄≤40 岁、女性性别、疾病持续时间短、浸润性肿瘤和较低的肿瘤体积，这些特征在一些研究中被认为是肿瘤生物学和预后的潜在指标，表明 ctDNA 水平可以作为肿瘤侵袭性的指标，辅助传统的活检 / 组织病理学评估。其次，虽然部分研究发现较高的 ctDNA 水平与高代谢肿瘤负荷之间存在正相关，但其他研究并未明确 ctDNA 与总体生存之间的联系，这反映了 ctDNA 动态变化的复杂性，强调了进一步研究以明确其预后意义的必要性。第三，血清 DNA 的微卫星分析是预测 OSCC 患者复发、转移和死亡的一种有前途的方法，同样，基于下一代测序（NGS）检测 TP53 突变的方法在预测 HNSCC 患者的无进展生存期和区域转移方面显示出潜力。
在纳入的 18 项研究中，10 项将 cfDNA 作为生物标志物进行评估，8 项聚焦于 ctDNA。在评估 cfDNA 的研究中，6 项报告了积极的结果，表明 cfDNA 水平与口腔和头颈部癌症的各种临床病理参数之间存在显著关联，这些关联包括 cfDNA 水平与肿瘤大小、淋巴结转移、晚期疾病、淋巴结转移和 OSCC 临床阶段的相关性，并且在 OSCC 患者中，cfDNA 浓度随着癌症阶段的升高而显著增加。然而，有 1 项研究发现不同口腔恶性肿瘤组之间的 cfDNA 水平没有显著差异，疾病进展与血液或血浆中 cfDNA 水平的变化也不相关。
相比之下，在关注 ctDNA 的研究中，7 项报告了积极结果，表明 ctDNA 作为口腔和头颈部癌症预后生物标志物的潜在效用，这些积极结果包括 ctDNA 水平升高与侵袭性肿瘤特征、不良预后、复发、区域转移和疾病进展之间的关联。值得注意的是，在一些研究中，ctDNA 无需进行侵入性肿瘤测序即可有效预测疾病进展和总体生存。然而，有 1 项研究未发现 HNSCC 患者中 ctDNA 突变与总体生存之间的关联。
总体而言，本系统综述的结果为 ctDNA 和 cfDNA 作为非侵入性生物标志物在口腔和头颈部癌症管理中的临床应用提供了有力证据。这些生物标志物在指导个性化治疗策略、监测疾病进展和改善患者预后方面具有广阔的前景。然而，还需要进一步开展大规模的前瞻性研究来验证这些发现，并促进 ctDNA 和 cfDNA 检测方法在常规临床实践中的应用。
在本次队列研究评估中，使用纽卡斯尔 - 渥太华量表（NOS）对 12 项研究进行评估，其中 8 项为高质量研究，4 项为中等质量研究。NOS 量表从研究组的选择、感兴趣的暴露或结果的确定以及组间可比性三个主要方面评估非随机研究的质量。在分析过程中发现，研究的一个常见局限性在于选择领域，特别是暴露队列的代表性问题。该标准用于评估研究队列是否准确反映了平均暴露人群，这会影响研究结果的普遍性。在本分析中，12 项研究中有 8 项未满足这一标准，导致其总体质量评级从高质量降至中等质量。队列缺乏代表性意味着研究人群可能无法准确反映更广泛的患者群体，从而限制了研究结果在普通人群中的适用性。这一问题至关重要，因为具有非代表性队列的研究可能产生在现实世界中无法广泛应用的结果，进而影响生物标志物检测结果的可靠性。此前的方法学评估已经强调了队列代表性在确保外部有效性方面的重要性，纽卡斯尔 - 渥太华量表编码手册也指出，队列应真实代表社区中的平均人群，以确保研究结果的适用性。未能实现队列代表性可能导致结果偏差，并限制研究在广泛临床环境中的应用价值。
未来的研究应纳入具有不同肿瘤阶段和风险因素的多样化、代表性队列，以提高研究结果的普遍性。采用多中心设计、连续抽样和标准化的生物标志物检测方法可以减少选择偏倚，提高 ctDNA 和 cfDNA 在口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的可靠性。
将循环肿瘤 DNA（ctDNA）和游离 DNA（cfDNA）应用于临床实践，有望推动个性化医学的发展，尤其是在治疗监测方面。这些生物标志物能够实现对肿瘤动态的非侵入性实时评估，有助于早期发现肿瘤耐药性和疾病进展。然而，检测方法（如数字聚合酶链反应（Digital Polymerase Chain Reaction，dPCR）和下一代测序（NGS））的灵敏度差异以及缺乏标准化协议等技术挑战，限制了它们的临床应用。标准化的分析前和分析程序将提高其可靠性，为更好的个性化治疗策略奠定基础。
在口腔癌诊断中，其他生物标志物和诊断技术可以与 ctDNA 和 cfDNA 相互补充。传统标志物如 p16 有助于评估 HPV 相关肿瘤，而正电子发射断层扫描 - 计算机断层扫描（Positron Emission Tomography-Computed Tomography，PET-CT）和磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）等成像方法能够提供详细的结构和功能信息。将这些方法与 ctDNA 和 cfDNA 相结合，可以更全面地评估肿瘤行为，提高诊断准确性、治疗监测效果和预后预测能力。
本研究的优势在于严格遵循 Cochrane 手册的指导方针，并按照 PRISMA 清单进行报告。在主要数据库中进行了全面检索，且研究针对明确的研究问题展开。
然而，本研究也存在一定的局限性。纳入的研究涉及不同的人群，部分研究聚焦于口腔鳞状细胞癌（OSCC），而另一些则关注头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）。由于临床异质性较高且效应量存在差异，无法对结果进行合并分析。此外，研究在样本量和方法学方面也存在差异。
结论
在本研究的局限性范围内，可以得出结论：循环肿瘤 DNA（ctDNA）和游离 DNA（cfDNA）在口腔鳞状细胞癌（OSCC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的预后和诊断方面具有显著的潜力。多项研究表明，cfDNA 水平升高与不良预后、淋巴结转移、较大肿瘤尺寸和晚期疾病阶段相关。同样，ctDNA 可作为预测工具，用于监测癌症进展、治疗反应、复发风险、转移和总体生存。
