新冠病毒 nsp16/nsp10 介导 2′-O RNA 甲基化的组装与调控机制研究：为抗病毒治疗提供关键靶点

本文解析了新冠病毒（SARS-CoV-2）nsp16/nsp10 复合物在 2′-O RNA 甲基化中的组装和调控机制。通过晶体结构等研究，发现其寡聚化及关键位点对甲基化的影响，为理解病毒免疫逃逸机制及开发靶向 nsp16/nsp10 的抗病毒药物提供依据。

　　### 新冠病毒 nsp16/nsp10 介导 2′-O RNA 甲基化的研究
新冠病毒（SARS-CoV-2）的 2′-O - 核糖甲基化修饰在其感染过程中起着关键作用。病毒通过修饰其 RNA 的 2′-OH，来逃避宿主的免疫识别并保护 mRNA 不被降解。这种修饰是由 nsp16 与 nsp10 形成的复合物共同完成的，该复合物能将 mRNA 帽从 Cap-0（^m7GpppA）转变为 Cap-1（^m7GpppAm），从而避免被宿主的 MDA5 等免疫传感器识别，引发的 I 型干扰素（IFN-I）抗病毒反应也会被抑制。因此，nsp16/nsp10 复合物成为极具潜力的抗病毒治疗靶点。然而，此前对于 nsp16 与 nsp10 如何在 mRNA 上组装以实现高效甲基化的机制尚不完全清楚。

CoV RNA 底物偏好

冠状病毒（CoVs）拥有所有正链 RNA 病毒中最长的基因组，其 5′端的前 394 个核苷酸会折叠成多种二级结构元件，其中包含一个约 75 nt 的前导序列，对病毒的转录至关重要。为探究 SARS-CoV-2 的 nsp16/nsp10 对 RNA 底物长度的偏好，研究人员合成了三种不同长度的 Cap-0 RNA 寡核苷酸，分别为 10-mer、16-mer 和 33-mer，它们涵盖了 SARS-CoV-2 mRNA 不同长度的序列。通过放射性测定法检测发现，10-mer RNA 作为底物时可检测到显著的甲基化，添加更多核苷酸到 3′端（如 16-mer）能进一步增强 nsp16 的活性，但 33-mer RNA 并未使甲基化水平进一步提高。这表明从 N₁到 N₁₆的核苷酸对于最佳的 2′-O 甲基化至关重要。

结晶及 SARS-CoV-2 nsp16/nsp10 复合物的结构测定

此前虽有 nsp16/nsp10 与短 6-mer Cap-0 RNA 复合物的结构报道，但这些结构是通过将短 Cap-0 RNA 浸泡到无配体的 nsp16/nsp10 晶体中获得的。鉴于 nsp16/nsp10 在较长 RNA 存在时甲基化活性更高，研究人员尝试将 SARS-CoV-2 nsp16/nsp10 复合物与较长的 Cap-0 RNA 共结晶。最终，他们成功获得了与 10-mer Cap-0 RNA 和 SAH（甲基化副产物）共结晶的复合物晶体，其分辨率约为 2.4 ?，属于单斜空间群（P2₁）。通过分子置换法解析结构后发现，模型包含两条 nsp16 链和两条 nsp10 链，部分 RNA 和 SAH 的电子密度也被清晰解析。值得注意的是，尽管使用的是底物 RNA（Cap-0）进行共结晶，但电子密度显示 RNA 为产物形式（Cap-1），表明发生了晶体中的甲基转移。

nsp16/nsp10/^m7GpppA_m1 RNA 复合物的整体结构

通过对 nsp16/nsp10 异四聚体复合物与先前报道的不同结构进行比较，发现其核心结构具有高度相似性，但该异四聚体结构也揭示了一些新特征。nsp10 与 nsp16 的结合能刺激其 RNA 结合和催化活性，二者的结合界面在较长 RNA 存在时，埋藏表面积增加，相互作用更强。此外，两个 nsp16/nsp10 异二聚体的组装形成了一个新的稳定的 nsp16-nsp16 界面，该界面包含一个芳香拉链样基序，由 Trp5、Tyr242 和 Phe245 等残基组成，对维持复合物的稳定性和功能具有重要意义。同时，nsp10 的 N 端区域（N - 螺旋）在与 RNA 结合时呈现出特定的取向，靠近 RNA 的 A₄碱基，对稳定 RNA 起到关键作用，缺失该区域会显著降低 RNA 甲基化活性。

经典的 nsp16/nsp10 界面

经典的 nsp16/nsp10 界面由保守的疏水和静电相互作用稳定。较长的 RNA 会使该界面的埋藏表面积增加，例如 Leu45 和 His80 等关键残基的埋藏表面积增大，从而增强了异二聚体的稳定性。其中，Leu45 插入 nsp16 的疏水口袋中，而 His80 附近的静电相互作用在界面稳定中也起着重要作用。

nsp16/nsp10 复合物中的新异四聚体界面

四聚体组装揭示的新 nsp16-nsp16 同二聚体界面，除了芳香拉链样基序外，还有其他疏水、范德华力和静电相互作用进一步稳定该界面。例如，Gln238、Leu239 等残基参与形成了额外的相互作用，扩展了总埋藏表面积。此外，nsp10-nsp10 界面的 Thr49 和 Met63 对也为异四聚体界面提供了额外的支持。

扩展的 RNA 结合凹槽与 2′-O - 甲基化的调控

nsp16 的两个门环围绕着 RNA 帽的末端和目标 A₁碱基，U₂和 U₃碱基的取向和相互作用也对 RNA 的稳定起到重要作用。如 U₃与 Ser33 等残基形成氢键，其核糖则由 Ser33 侧链和镁离子稳定。研究发现，nsp16 中 Ser33 突变为 Arg 或 Ala 会导致酶活性丧失，这解释了临床变体中该突变的意义。同时，两个 nsp16 的反向排列形成了一个连续的正电荷表面，可能与下游 RNA 结合，虽然目前未观察到 RNA 碱基在该区域的强电子密度，但推测其可能与完整的茎环序列结合。此外，研究人员还验证了 nsp16 上一个先前报道的配体 / 核苷酸结合口袋，突变该口袋中的残基会不同程度地降低 2′-O - 核糖甲基化活性，表明该口袋在甲基化过程中起着关键的调节作用。

nsp10 和 nsp16 的 N 端结构域对 RNA 稳定的需求

nsp10 的 N 端包含两个螺旋，H1（N - 螺旋）和 H2。H1 在不同的 nsp10 结构中存在线性和折返两种构象，在与较长 RNA 共结晶的当前四聚体复合物中，H1 呈折返构象，这种构象通过 Asn10 和 Thr39 等残基之间的氢键网络得以稳定。Pro8 在其中起到关键作用，它作为螺旋破坏者，为 nsp10 的 N 端区域提供了与 nsp16 结合的 RNA 相互作用的灵活性。缺失 nsp10 的 N - 螺旋会导致酶活性显著降低，突出了其在 SARS-CoV-2 RNA 高效 2′-O - 甲基化中的关键作用。通过化学交联和免疫印迹实验发现，nsp16/nsp10 在溶液中倾向于形成异四聚体，RNA 能促进 nsp16-nsp16 二聚体的形成，而突变 nsp16-nsp16 界面的关键残基会破坏异四聚体的形成，影响 RNA 甲基化活性。

研究讨论

SARS-CoV-2 通过修饰其 RNA 的 5′端来逃避宿主免疫并利用宿主的蛋白质合成机制。研究人员解析的 nsp16/nsp10 与 10-mer Cap-1 RNA 的共晶体结构显示，该复合物形成了独特的结构，产生了连续的正电荷表面，可能用于稳定更长的 RNA。虽然非特异性核苷酸结合口袋的特异性尚不清楚，但突变数据表明其在 2′-O-MTase 活性中起重要作用。此外，nsp10 的 N - 螺旋靠近 RNA，暗示其对酶活性的重要性，且 nsp16 的变构调节可能通过 nsp10 的 N 端发生。蛋白质寡聚化似乎是 SARS-CoV-2 甲基转移酶修饰和保护病毒 RNA 免受宿主免疫传感器检测的关键策略，而较长的 RNA 对高效 2′-O 甲基化的积极影响可能是病毒甲基转移酶的普遍需求。未来的研究将进一步揭示 nsp16 与宿主剪接机制成分的相互作用模式，以及 nsp16/nsp10 异四聚体复合物在生理条件下的具体作用。

资源可用性

本研究的相关资源和试剂可向主要联系人 Yogesh K. Gupta（[e-mail]）索取，独特或稳定的试剂在有库存的情况下将按要求提供，可能需要签署材料转移协议。研究的原子坐标和结构因子文件已存入蛋白质数据库，登录号为 8VUO，相关数据可公开获取。