放疗新发现：肿瘤内源性干性 CD8+T 细胞驱动放疗抗肿瘤免疫效应

本文研究发现，放疗可促进肿瘤内源性 CD8+T 细胞增殖分化，其中 TCF-1+的干性 CD8+T 细胞起关键作用，是放疗诱导肿瘤免疫的关键驱动因素。该成果为理解放疗机制及优化癌症治疗提供了重要依据，值得关注。

　　

研究背景

CD8⁺T 细胞在自发和治疗诱导的肿瘤控制中至关重要。放疗是常用的癌症治疗方法，除对癌细胞有基因毒性外，还能促进局部炎症反应，增强肿瘤特异性免疫。然而，放疗对肿瘤相关 CD8⁺T 细胞的具体影响尚不明确，且肿瘤浸润的 CD8⁺T 细胞存在显著异质性。此外，一种具有干细胞特性的 CD8⁺T 细胞（TCF-1⁺PD-1⁺TIM-3^?）在肿瘤免疫治疗中备受关注，但放疗对其影响及在放疗疗效中的作用也不清楚。本研究旨在探究放疗对肿瘤内 CD8⁺T 细胞的影响。

研究方法

1. 动物模型：使用 C57BL/6 小鼠，构建多种肿瘤模型，如皮下接种 MC38、MC38-OVA、B16-OVA、LLC-OVA 等肿瘤细胞。
2. 细胞系和细胞培养：培养多种肿瘤细胞系，包括 MC38、B16F10 等，对细胞进行相关处理和检测，确保细胞无污染且状态良好。
3. 体内实验
   • 癌症细胞注射：将培养的肿瘤细胞与 Matrigel 混合后，皮下注射到小鼠右侧胁部，用于后续实验。
   • 细胞耗竭：通过注射特定抗体，如抗 CD4、抗 CD8、抗 Thy1.2 抗体等，或给予白喉毒素（DTX），耗竭相应的细胞群体。
   • FTY720 给药：通过口服给予小鼠 FTY720，阻止淋巴细胞从次级淋巴器官进入血液，以研究肿瘤内预先存在的 CD8⁺T 细胞的作用。
   • 过继转移 T 细胞：从 OT-I 小鼠脾脏分离 CD8⁺T 细胞，过继转移到受体小鼠体内，观察其在肿瘤免疫中的作用。
   • 放疗：对荷瘤小鼠进行局部放疗，使用特定剂量的辐射，如 20 Gy，观察肿瘤生长和免疫细胞变化。
   • 骨髓嵌合体构建：通过对小鼠进行全身照射后，移植特定小鼠的骨髓细胞，构建骨髓嵌合体小鼠模型。
4. 组织收集和处理：收集肿瘤、肿瘤引流淋巴结（tdLNs）和脾脏等组织，进行处理以获得单细胞悬液，用于后续分析。
5. 流式细胞术：对单细胞悬液进行染色，标记多种细胞表面和胞内分子，利用流式细胞仪检测，分析细胞表型和功能变化。
6. 单细胞 RNA 测序：对分选的肿瘤内 CD8⁺T 细胞进行单细胞 RNA 测序，分析细胞的基因表达谱，确定细胞亚群和分化轨迹。
7. 数据分析：使用多种软件和算法，如 FlowJo、GraphPad Prism、R 语言中的相关包等，对实验数据进行统计分析和可视化处理。

研究结果

1. 放疗导致肿瘤内 CD8⁺T 细胞激活和分化：放疗后，肿瘤生长得到有效控制，肿瘤内 CD8⁺T 细胞数量显著增加。这些细胞的表型和功能发生变化，如 CD62L⁺细胞频率降低，PD-1⁺、TIM-3⁺和 granzyme B（GZMB）⁺细胞频率升高，Ki-67⁺细胞频率增加，表明放疗诱导了肿瘤内 CD8⁺T 细胞的分化和增殖。
2. 预先存在的肿瘤内 CD8⁺T 细胞对放疗疗效至关重要：通过使用 FTY720 阻断新的 CD8⁺T 细胞浸润，发现预先存在的肿瘤内 CD8⁺T 细胞足以维持放疗的疗效。放疗后，这些细胞发生增殖和分化，且放疗诱导的 CD8⁺T 细胞聚类变化不受 FTY720 处理的影响。在不同肿瘤模型中均得到类似结果，证明该发现具有普遍性。
3. 放疗诱导预先存在的肿瘤内 CD8⁺T 细胞增殖和分化：在放疗后的不同时间点对预先存在的肿瘤内 CD8⁺T 细胞进行分析，发现其数量在放疗后 1 天减少，3 天后开始增加，6 - 9 天持续增加，同时伴随肿瘤的逐渐缩小。这表明放疗诱导了预先存在的肿瘤内 CD8⁺T 细胞的增殖和分化，且该过程具有时间依赖性。此外，较高的辐射剂量可增强这种增殖和分化反应，20 Gy 是测试剂量中最有效的。
4. 放疗诱导预先存在的肿瘤内干性 CD8⁺T 细胞增殖和分化：通过单细胞 RNA 测序，鉴定出肿瘤内 CD8⁺T 细胞的多种表型，包括幼稚样、早期激活、干性、效应 / 记忆和耗竭型。放疗减少了幼稚样细胞的频率，促进了干性 CD8⁺T 细胞的增殖，使其向效应细胞分化。进一步分析发现，干性 CD8⁺T 细胞存在不同的亚群，其中一些亚群在放疗后表现出更强的增殖能力。
5. TCF-1⁺细胞对放疗诱导的 CD8⁺T 细胞免疫反应至关重要：利用 Tcf7^DTR?GFP小鼠模型，选择性耗竭 TCF-1⁺细胞后发现，放疗诱导的肿瘤控制效果减弱，CD8⁺T 细胞的增殖和分化也受到抑制。这表明 TCF-1⁺细胞是肿瘤内增殖和分化 T 细胞的前体，对维持放疗诱导的免疫反应至关重要。
6. 干性 CD8⁺T 细胞在放疗后分化和增殖：将分选的肿瘤内 TCF-1^?PD-1⁺（效应）和 TCF-1⁺PD-1⁺（干性）CD8⁺T 细胞过继转移到 Tcrb^?/?小鼠体内，发现接受干性 CD8⁺T 细胞的小鼠在放疗后，肿瘤和 tdLNs 中的 CD8⁺T 细胞数量显著增加，且这些细胞在肿瘤内发生了分化。这表明干性 CD8⁺T 细胞在放疗后能够分化和增殖，是放疗诱导肿瘤免疫的重要前体。

研究讨论

1. 放疗对肿瘤内 CD8⁺T 细胞的影响机制：放疗诱导肿瘤控制的效果与预先存在的肿瘤内 CD8⁺T 细胞密切相关。这些细胞部分具有放射抗性，放疗可促进其增殖和分化。放疗后 1 天，增殖的 CD8⁺T 细胞对放疗诱导的细胞死亡更敏感，导致数量减少；随后，存活的细胞发生增殖反应，在 6 天左右达到高峰，并呈辐射剂量依赖性。TCF-1⁺细胞，包括干性 CD8⁺T 细胞，对放疗反应至关重要，尽管 TCF-1^?CD8⁺T 细胞也有助于肿瘤控制，但干性 CD8⁺T 细胞在支持有效的 CD8⁺T 细胞反应中起重要作用。
2. 干性 CD8⁺T 细胞在肿瘤免疫中的作用：预先存在的肿瘤内 CD8⁺T 细胞在放疗初期可驱动有效的免疫反应，使肿瘤内 CD8⁺T 细胞发生分化。干性 CD8⁺T 细胞在 tdLN 中保存其干性，在放疗刺激下迁移到肿瘤内并迅速分化为效应细胞，这与之前的研究结果一致，即淋巴结是干性 CD8⁺T 细胞的储存库，可迁移到肿瘤内限制肿瘤进展。测序结果也证实，放疗后肿瘤内 CD8⁺T 细胞获得更分化的表型，且当新的浸润被阻断时，这种分化更为明显，提示持续从淋巴结招募细胞可能对长期抗肿瘤反应至关重要。
3. 与其他治疗方法的联合应用：PD-1/PD-L1 阻断与放疗具有协同作用，目前正在临床研究中。干性 CD8⁺T 细胞对 PD-1 阻断治疗的反应至关重要，本研究表明其在放疗反应中可能也发挥类似作用，这为解释两种治疗联合应用的协同效应提供了理论依据。
4. 研究的局限性：本研究主要基于小鼠肿瘤模型，使用的是皮下肿瘤模型，无法使用自发肿瘤模型，且放疗方案与临床标准治疗存在差异。此外，由于无法获取足够的人类患者样本，研究结果尚未在人体中得到验证。

研究结论

本研究表明，放疗可促进预先存在的肿瘤内 CD8⁺T 细胞，尤其是干性 CD8⁺T 细胞的增殖和分化，这一过程在放疗初期对治疗效果至关重要。然而，持续的抗肿瘤反应可能需要从 tdLNs 招募干性 CD8⁺T 细胞。该研究为理解放疗诱导的肿瘤免疫机制提供了新的视角，为优化癌症治疗策略提供了理论基础。未来的研究需要进一步探讨如何更好地利用干性 CD8⁺T 细胞，提高放疗及联合治疗的疗效，同时需在人体研究中验证这些发现。