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本文聚焦细胞周期蛋白依赖性激酶样 5（CDKL5）缺陷障碍（CDD）。通过对 CDKL5 基因敲除小鼠模型的研究，发现肠道菌群变化与疾病相关。抗生素治疗可改善症状，粪菌移植能转移表型。这为 CDD 治疗提供新思路，极具研究价值。
CDKL5 缺陷障碍与肠道菌群关联研究背景
细胞周期蛋白依赖性激酶样 5（CDKL5）缺陷障碍（CDD）是一种罕见的 X 连锁早发性脑病，由 CDKL5 基因突变引起，发病率约为 1/40,000 - 1/60,000 活产儿。患者存在严重的全球发育迟缓，包括早发性癫痫性脑病、智力残疾、视觉和运动障碍、肌张力低下、睡眠障碍和手部刻板动作等症状 。而且，CDD 患者常伴有胃肠道（GI）问题，如腹泻、便秘和胃酸反流，还可能存在亚临床免疫失调，这或许与肠道菌群异常有关。已有研究发现，自闭症谱系障碍（ASD）患者中胃肠道功能障碍更为常见，且与中枢神经系统（CNS）相关合并症密切相关，提示肠道和大脑功能障碍在神经发育障碍中可能存在关联，这种关联可能部分源于肠道微生物组的异常。此前研究还发现，ASD 和雷特综合征（RTT）患者的肠道菌群组成存在改变，近期研究也显示 CDD 患者的肠道微生物多样性和组成存在差异 。然而，在常用的 CDD 模型中，肠道菌群的组成以及其变化对神经相关结果的影响尚未得到充分研究。
CDKL5 基因敲除小鼠粪便微生物群组成的改变
为探究肠道细菌组成，研究人员从 CDKL5 基因敲除（KO）小鼠和野生型（WT）小鼠纵向收集新鲜粪便样本，分别在出生后第 25 天（P25）、第 32 天（P32）和成年期第 70 天（P70）进行采样。考虑到肠道菌群易受环境因素影响，研究选用了在意大利比萨和德国柏林两个不同动物设施中饲养的 CDKL5 基因敲除小鼠模型。对采集的粪便样本提取细菌 DNA，进行 16S rRNA 测序（rRNA - seq）分析。首先计算 alpha 多样性，结果显示在柏林饲养的 CDKL5 基因敲除小鼠在 P32 时，Chao1 指数和观察到的操作分类单元（OTU）显著降低，来自比萨的 CDKL5 基因敲除小鼠也呈现出 alpha 多样性下降的趋势；同时，柏林饲养的 CDKL5 基因敲除小鼠在 P25 时，Shannon 指数和 Simpson 指数相较于 WT 同窝小鼠降低 。其次计算 beta 多样性，通过主坐标分析（PCoA）发现，在比萨饲养的小鼠中，P32 时 CDKL5 基因敲除小鼠与 WT 同窝小鼠的粪便微生物群存在显著的系统发育差异；在柏林饲养的小鼠中，P25 时两者也存在显著差异 。最后，利用线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）方法探索细菌组成差异，结果表明在比萨和柏林的设施中，WT 小鼠和 CDKL5 基因敲除小鼠之间均存在分类学差异。在比萨设施中，P25 和 P32 时差异更为明显，如 Alcaligenaceae 科、Burkholderiales 目和 Pasteurellales 目在 CDKL5 基因敲除小鼠的微生物群中富集，且这些分类群属于 Proteobacteria 门，该门被认为可能是疾病的微生物标志；此外，Bacteroidaceae 科在 CDKL5 基因敲除小鼠的粪便微生物群中在所有年龄段均显著富集 。在柏林设施中，P25 时 CDKL5 基因敲除小鼠的微生物群中 Porphyromodanaceae 科、Prevotellaceae 科和 Lactobacillaceae 科等显著富集；P70 时，WT 小鼠的微生物群中与肠道健康和益生菌相关的分类群（如 Bifidobacteriaceae 科）相较于 CDKL5 基因敲除小鼠有所富集，且双歧杆菌（Bifidobacterium longum）在两个 CDD 小鼠模型的 P70 时均显著减少 。进一步去除 “动物设施” 变量进行 LEfSe 分析，发现 P25 时 CDKL5 基因敲除小鼠的 Burkholderiales 目、Alcaligenaceae 科和 Bacteroidales 目等分类群显著富集；P25 和 P32 时，Bacteroides rodentium在 CDKL5 基因敲除小鼠的微生物群中富集；P70 时，CDD 小鼠的微生物群中Allobaculum和Parapedobacter属相较于 WT 同窝小鼠存在缺陷 。尽管两个设施中的差异不完全重叠，但均表明在幼年阶段，CDKL5 基因敲除小鼠与 WT 小鼠的肠道菌群存在显著差异。在观察肠道菌群差异的基础上，研究人员对幼年小鼠的肠道结构和功能进行了研究。结果显示，CDKL5 基因敲除小鼠和 WT 同窝小鼠在粪便含水量、排便频率、胃排空时间、总胃肠道长度和结肠长度等方面均未检测到显著差异 。然而，CDKL5 基因敲除小鼠结肠中 trefoil factor 3（Tff3）、zonula occludens 1（tight junction protein 1，Tjp1）和 claudin 1（Cldn1）的基因表达显著增加，同时结肠中单核细胞浸润增加，脾脏重量增加，结肠结构也发生变化，如肌肉层宽度增加、隐窝层深度减少，这表明 CDKL5 基因敲除小鼠可能存在肠道结构重塑，以适应炎症或改变的肠道内环境稳态。
抗生素治疗改善 CDKL5 基因敲除小鼠的功能和行为结果
鉴于 CDKL5 粪便微生物群组成存在差异，研究人员推测存在肠道微生物失衡的情况。在多种神经精神疾病中都观察到了微生物群失调（dysbiosis），且在小鼠模型中，其与行为和大脑功能损伤相关 。因此，研究人员用抗生素鸡尾酒（ABX）处理来自比萨设施的小鼠，以靶向肠道微生物，尤其是细菌类群，并测试其对功能和行为结果的改善作用。由于在幼年阶段 CDKL5 基因敲除小鼠的粪便微生物群差异显著，小鼠从断奶（P21）开始接受 ABX 处理，持续 24 天 。在处理过程中，研究人员监测了小鼠的体重，发现 ABX 处理的 CDKL5 基因敲除小鼠在 P28 时体重相较于对照组（CTRL，饮用普通水）略有但显著降低，在 P34 和 P45 时也呈现类似趋势；而 WT ABX 小鼠相较于 WT CTRL 小鼠仅呈现体重下降的趋势 。同时，研究人员检测了 ABX 处理的效果，发现 ABX 处理后，CDKL5 基因敲除小鼠和 WT 小鼠粪便中的细菌 DNA 浓度相较于各自对照组均显著降低 。CDD 患者和 CDKL5 基因敲除小鼠均存在视觉缺陷 。在 ABX 处理 13 天后，研究人员通过光学成像测量内在信号（IOS）来评估视觉皮层反应。结果显示，CDKL5 KO CTRL 小鼠的视觉反应幅度相较于 WT CTRL 小鼠显著降低，而 ABX 处理可挽救视觉反应损伤，使信号幅度恢复到 WT CTRL 小鼠的水平，且 ABX 处理对 WT 小鼠的视觉神经元反应幅度无影响 。随后，研究人员探索 ABX 对 CDD 小鼠行为缺陷的改善作用。在筑巢行为实验中，CDKL5 KO CTRL 小鼠相较于 WT CTRL 和 WT ABX 小鼠表现出筑巢行为受损，ABX 处理未能改善突变小鼠的筑巢行为，对 WT 小鼠的表现也无影响 。在后肢抓握实验中，CDKL5 KO CTRL 小鼠相较于 WT CTRL 组存在运动协调缺陷，ABX 处理对此也无改善作用 。在 Y 迷宫实验中，CDKL5 KO CTRL 小鼠的总进入次数、总移动距离和速度均高于 WT CTRL 小鼠，表现出多动表型，而 ABX 处理可使这些指标恢复到 WT 小鼠的水平，但对 Y 迷宫中交替百分比这一衡量工作记忆的指标无改善作用 。综上所述，靶向 CDKL5 缺陷小鼠的肠道菌群改变能够改善皮层神经元的功能特性，并改善特定的行为异常。
ABX 驱动的肠道菌群操纵对 CDKL5 基因敲除小鼠小胶质细胞表型的影响
肠道菌群对小胶质细胞的成熟、分化和功能具有重要影响 。有趣的是，CDKL5 突变体中的小胶质细胞呈现出典型的激活状态 。因此，研究人员探究 ABX 操纵肠道菌群组成是否能通过作用于小胶质细胞改善 CDKL5 基因敲除小鼠大脑中的潜在神经炎症状态。对视觉皮层中小胶质细胞胞体进行三维形态分析，结果显示 CDKL5 KO CTRL 小鼠和 WT CTRL 小鼠的胞体面积和体积无显著差异，但 ABX 处理显著降低了 WT 和 CDKL5 基因敲除小鼠的胞体面积和体积 。此外，CDKL5 KO CTRL 小鼠的小胶质细胞球形度相较于 WT CTRL 动物显著降低，ABX 处理仅在 CDKL5 基因敲除小鼠中挽救了这一特征，对 WT 小鼠的球形度无影响 。小胶质细胞的球形度降低可能表明 CDKL5 基因敲除小鼠的小胶质细胞处于激活边缘，而 ABX 处理可能使其恢复到监测状态。为进一步了解小胶质细胞的功能，研究人员通过 CD68 染色量化其溶酶体含量。结果显示，CDKL5 KO CTRL 小鼠的小胶质细胞中 CD68 表达相较于 WT CTRL 小鼠升高，但 ABX 处理对 CDKL5 基因敲除小鼠和 WT 小鼠的 CD68 水平均无影响，这可能表明 CDKL5 基因敲除小鼠的小胶质细胞具有更高的吞噬能力 。研究人员还对小胶质细胞的复杂性进行了研究，量化了丝状长度、分支点数量和末端点数量等参数。结果显示，CDKL5 KO CTRL 小鼠的小胶质细胞在这些参数上相较于 WT CTRL 组均显著降低，而 ABX 处理完全挽救了这一表型 。Sholl 分析进一步表明，CDKL5 KO CTRL 小鼠的细胞复杂性降低，ABX 处理使其恢复到 WT 水平，且 ABX 处理对 WT 小鼠的小胶质细胞分支和复杂性无影响 。此外，研究人员还对星形胶质细胞进行了研究，量化了其在视觉皮层中的密度，结果显示 WT 和 CDKL5 基因敲除小鼠之间无差异，ABX 处理也无影响 。总体而言，对小胶质细胞表型的研究表明，CDKL5 基因敲除小鼠大脑皮层中存在潜在的激活状态，可通过 ABX 操纵肠道菌群来对抗这种状态。
粪菌移植将 CDKL5 基因敲除小鼠的表型转移到 WT 受体小鼠
为进一步证明 CDKL5 基因敲除小鼠的微生物群对其表型的贡献，研究人员进行了粪菌移植（FT）实验。将 CDKL5 基因敲除小鼠或 WT 小鼠的粪便移植到 WT 受体动物体内 。在实验过程中监测受体小鼠的体重，发现各受体组之间无显著差异 。在 FT 后 12 天评估视觉反应，结果显示，接受 CDKL5 基因敲除小鼠粪便移植的 KO - FT 小鼠，其视觉反应幅度相较于接受 WT 小鼠粪便移植的对照组（WT - FT）显著降低，与 CDKL5 基因敲除动物的 IOS 成像反应降低情况相似 。在 Y 迷宫实验中，KO - FT 小鼠的总进入次数相较于 WT - FT 小鼠显著增加，与 CDKL5 基因敲除组的行为相似，但在总移动距离、速度和交替百分比方面无差异 。FT 结果进一步强调了肠道菌群在塑造 CDD 小鼠模型行为和皮层反应中的关键作用，证明 FT 是转移神经表型的有效工具。
研究讨论
本研究在两个 CDD 小鼠模型及其 WT 同窝小鼠中，发现了肠道菌群发育成熟模式的明显差异。这些差异受多种因素影响，包括模型类型、年龄和饲养设施等。尽管存在差异，但研究仍发现了 CDD 的微生物特征，即特定细菌类群的失调，且这些变化在不同设施中具有一致性。在幼年阶段，CDKL5 基因敲除小鼠与 WT 同窝小鼠的肠道菌群差异最为显著。在柏林饲养的小鼠中，P25 和 P32 时 alpha 多样性降低；在比萨饲养的 CDKL5 基因敲除小鼠中，P25 和 P32 时 Proteobacteria 门的分类群显著富集，这可能与肠道炎症有关，因为在这些小鼠的结肠中观察到单核细胞浸润增加、隐窝深度减少和肌肉层宽度增加等变化，同时tff3基因表达升高 。此外，近期研究表明 Proteobacteria 与肠道 - 大脑轴的调节有关，在饮食诱导肥胖的小鼠模型中，肠道 Proteobacteria 增加与神经炎症、探索障碍和焦虑样行为相关 。在 CDD 患者中，也观察到肠道 Proteobacteria 的变化，且与胃肠道症状严重程度相关 。在柏林饲养的 CDKL5 基因敲除小鼠中，P25 时 Bacteroidaceae 科富集，这一现象在比萨的 CDKL5 基因敲除小鼠群体中也存在，表明其可能是 CDD 微生物群的一个共同特征。Bacteroidaceae 科的扩张与多种疾病相关，如结肠炎、肝硬化炎症、阿尔茨海默病和炎症性肠病（IBD）等 。而在 P70 时，两个 CDD 小鼠模型中的B. longum均减少，B. longum作为益生菌，其减少表明肠道微生物组成可能失衡，有益细菌缺乏，影响肠道内环境稳态 。通过去除 “小鼠设施” 变量进行 LEfSe 分析，发现了一些在不同设施的 CDKL5 基因敲除小鼠中共同变化的分类群。P25 时，Burkholderiales 目和 Bacteroidales 目在 CDKL5 基因敲除小鼠中富集，其中B. rodentium在 P25 和 P32 时增加，但目前尚未有关于该分类群对肠道 - 微生物群 - 大脑轴影响的报道 。P70 时，Allobaculum减少，Allobaculum被认为是有益微生物，其减少可能影响肠道健康 。综合来看，本研究的多站点实验表明，小鼠遗传学（即 CDKL5 蛋白的缺失）和环境条件（即两个不同地理位置的设施）相互作用，共同塑造了肠道菌群。先前研究表明环境因素在决定肠道菌群组成方面起主导作用，本研究结果在很大程度上证实了这一点 。研究还确定了在 CDKL5 基因敲除小鼠模型中特定年龄阶段持续变化的微生物分类群，这些分类群可被视为 CDKL5 基因敲除的特征微生物，暗示了遗传学的影响，也表明 CDKL5 功能受损可能特异性地塑造肠道菌群的组成，但其具体机制尚不清楚，可能与 CDKL5 在肠神经系统或不同类型肠道细胞中的作用有关。
治疗 CDKL5 基因敲除小鼠肠道菌群改变改善表型损伤
CDD 小鼠中存在促炎的失调微生物群落，这表明肠道菌群可能对其表型有贡献。研究结果显示，ABX 处理可改善 CDKL5 基因敲除小鼠的多种表型，支持了这一观点 。ABX 处理能够提高 CDKL5 基因敲除小鼠的视觉反应幅度，而视觉障碍是 CDD 患者的常见症状，改善这一症状强调了肠道 - 大脑异常相互作用在 CDD 中的重要性，其影响超出了胃肠道功能障碍 。然而，ABX 处理对 CDKL5 基因敲除小鼠的筑巢行为无影响，这表明筑巢这种涉及执行功能的复杂行为可能不受 ABX 处理的改善 。在 Y 迷宫实验中，ABX 处理虽未影响工作记忆，但可使 CDKL5 基因敲除小鼠的多动行为恢复正常，这可能与小胶质细胞异常有关，因为小胶质细胞在啮齿动物的多动行为和人类注意力缺陷多动障碍的严重程度中起作用 。在肠道 - 大脑轴研究中，揭示肠道菌群影响远端组织的细胞机制和潜在介质是一个重大挑战。鉴于 CDD 患者存在亚临床炎症，且外周和中枢炎症过程之间存在相互作用，研究人员对小胶质细胞行为进行了探索 。小胶质细胞是大脑实质中的主要免疫细胞，在神经炎症中起关键作用，同时也参与突触重塑和神经元回路的可塑性 。在 CDKL5 基因敲除小鼠中，小胶质细胞处于激活状态，ABX 处理可增加其细胞体球形度，使其恢复到 WT 小鼠的水平，并挽救了与分支复杂性相关的其他形态表型，这可能与小胶质细胞感知和监测周围环境、防止潜在有害病原体或分子以及神经元网络的不适应激活的能力有关 。ABX 处理对 WT 小鼠的小胶质细胞形状影响较小，与先前报道一致 。虽然 ABX 处理在 CDD 小鼠模型中改善了多种表型，但仅通过 ABX 处理不能直接证实这些补偿效应是由肠道菌群操纵或随后的微生物信号传递到大脑引起的。因此，研究人员采用粪菌移植这一补充方法，成功将 CDKL5 基因敲除小鼠的关键神经缺陷表型转移到 WT 受体小鼠中，进一步强调了肠道微生物信号在调节行为和大脑功能结果中的关键作用，突出了微生物群对神经发育障碍的影响。
针对 CDD 靶向肠道菌群的转化前景
本研究强调了靶向肠道菌群缓解 CDD 症状的潜在有效性。通过多站点研究，在 CDD 小鼠模型中发现的肠道菌群改变与患者中的差异相似 。潜在促炎分类群（如 Bacteroidaceae 科、Enterobacteriaceae 科）的存在和有益细菌（如B. longum）的减少，可能导致炎症状态，激活小胶质细胞，影响神经症状的严重程度 。ABX 处理改善了神经结果和小胶质细胞形态，表明其可部分缓解与 CDD 相关的潜在炎症 。值得注意的是，人类肠道炎症与癫痫发作和抗癫痫药物反应改变有关，对于患有难治性癫痫、存在亚临床炎症和免疫失调的 CDD 患者来说，这是一个关键考虑因素 。因此，本研究结果表明，利用可调节的肠道菌群作为新靶点，通过减轻外周和潜在的大脑低度炎症来缓解症状<
