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在神经发育研究中，Sonic hedgehog（Shh）对轴突导向作用机制不明。研究人员围绕 Numb/Nbl 在 Shh 介导的轴突排斥过程展开研究。结果显示，Numb/Nbl 对 iRGC 轴突在视交叉的排斥及脊髓连合轴突中线交叉后的排斥至关重要，这为揭示 Shh 信号通路机制提供关键依据。
在神经发育的奇妙世界里，神经元的 “电线”—— 轴突，需要精准地生长并连接到正确的目标，这一过程就像在复杂迷宫中找到正确的路径，而引导轴突的关键线索之一就是 Sonic hedgehog（Shh）蛋白 。Shh 就像一个 “双面间谍”，在不同的神经元类型和发育阶段，它既可以作为吸引轴突的 “磁石”，也能充当排斥轴突的 “盾牌”。在发育中的脊髓里，Shh 一开始会引导连合轴突（commissural axons）向底板（floor plate）生长，就像用面包屑吸引小鸭子一样；但当轴突穿过中线后，Shh 又会将它们推开。在视觉系统发育中，Shh 则负责在视交叉（optic chiasm）处推开同侧视网膜神经节细胞（ipsilateral retinal ganglion cell，iRGC）的轴突。
然而，长期以来，科学家们对 Shh 这种 “双面性” 背后的分子机制感到十分困惑。尤其是在 Shh 介导的轴突排斥过程中，其具体的作用方式以及相关的关键分子仍不明确。为了解开这些谜团，来自蒙特利尔临床研究所（Montreal Clinical Research Institute，IRCM）、麦吉尔大学（McGill University）等多个研究机构的研究人员 Tiphaine Dolique、Sarah Baudet、Frederic Charron 和 Julien Ferent 等开展了深入研究。
他们的研究聚焦于 Numb 和它的同源蛋白 Numb-like（Nbl），探究这两种蛋白在 Shh 介导的轴突排斥过程中的作用。研究成果发表在《iScience》杂志上，为理解神经发育过程中轴突导向的分子机制提供了重要线索。
研究人员运用了多种技术方法来深入探索这一问题。在实验动物模型方面，使用了基因编辑小鼠，如 Sert-Cre 小鼠和 Atoh1-Cre 小鼠，通过特定的 Cre 重组酶驱动，实现对 Numb/Nbl 基因在特定细胞类型中的条件性敲除（conditional knockout，cKO） 。在检测技术上，利用免疫染色（immunostaining）技术，结合多种特异性抗体，来观察 Numb/Nbl 在不同神经元中的表达和定位；运用 DiI 和霍乱毒素亚基 B（Cholera Toxin Subunit B，CTB）追踪技术，标记轴突，进而分析轴突的投射和定位情况；还通过视网膜外植体培养和生长锥塌陷实验，研究 Shh 对 iRGC 轴突的影响。
研究结果如下：
- Numb 和 Nbl 在 iRGCs 中表达：研究人员通过免疫染色发现，Numb 和 Nbl 在 iRGCs 中广泛表达，在视网膜神经节细胞层（RGC layer）表达量较高，并且在视神经和视交叉处也有明显信号，在轴突中也有定位，暗示其可能在 iRGCs 远距离发挥作用。
- Numb/Nbl iRGC 条件性敲除不影响眼形态和 iRGC 特化：利用 Sert-Cre 小鼠系构建 Numb/Nbl 条件性敲除小鼠（Sert-Cre cDKO），研究发现，与对照小鼠相比，Sert-Cre cDKO 小鼠的眼睛在形态测量上，如眼直径、视网膜面积等，没有显著差异。同时，对 iRGC 特化标记物 Zic2 的染色分析表明，Numb/Nbl 的缺失不影响 iRGC 的产生和存活。
- Numb/Nbl 对体内同侧轴突分离至关重要：通过向小鼠眼睛注射 DiI 并分析其在视神经束中的荧光强度，研究人员发现，Sert-Cre cDKO 小鼠同侧视神经束中 DiI 荧光强度占比显著下降；利用 CTB 追踪技术进一步观察视网膜神经节细胞轴突在背外侧膝状体核（dorsal lateral geniculate nucleus，dLGN）的投射，发现 Sert-Cre cDKO 小鼠同侧投射的荧光强度降低，这表明 Numb/Nbl 对 iRGC 轴突在视交叉的正确导向和在 dLGN 的最终分离至关重要。
- Numb/Nbl 是 Shh 诱导的 iRGCs 生长锥塌陷所必需的：在视网膜外植体实验中，研究人员通过 shRNA 敲低 Numb 和 Nbl，结果显示，Shh 诱导的 iRGCs 生长锥塌陷效应被阻断；而共表达 shRNA 抗性形式的 Numb 或 Nbl 能够挽救这一效应，表明 Numb/Nbl 对于 Shh 介导的 iRGCs 生长锥塌陷是必需的。
- Numb/Nbl 对发育中脊髓中线交叉后的导向至关重要：研究人员发现 Numb/Nbl 在脊髓连合神经元中表达，且在轴突穿过中线后表达量仍然较高。通过构建 Atoh1-Cre cDKO 小鼠模型，分析连合轴突在中线交叉后的导向情况，发现 Numb/Nbl 缺失导致向神经管前部导向的轴突比例显著下降，表明 Numb/Nbl 在脊髓连合轴突中线交叉后的纵向导向中发挥重要作用。
研究结论和讨论部分指出，Numb/Nbl 在两个不同的神经发育系统中，即视觉系统中 iRGC 的分离和脊髓中连合轴突中线交叉后的前后导向，对轴突排斥导向起着关键作用。结合之前的研究，Numb/Nbl 不仅参与 Shh 介导的吸引过程，也参与排斥过程，这表明 Numb/Nbl 是 Shh 信号通路在多种神经发育功能中的重要组成部分。此外，研究还发现 Numb 和 Nbl 在功能上存在一定的差异，Nbl 在轴突排斥过程中能够挽救 Numb 的缺失，但在吸引过程中则不能，这可能与吸引和排斥过程中对不同内吞作用的需求有关。
该研究的重要意义在于，首次明确了 Numb/Nbl 在 Shh 介导的轴突排斥过程中的关键作用，为深入理解 Shh 信号通路在神经发育中的功能提供了重要依据。同时，研究也揭示了内吞作用在 Shh 信号通路多效性功能中的重要性，为后续研究神经发育相关疾病的发病机制和潜在治疗靶点提供了新的方向。然而，研究也存在一定的局限性，例如尚未明确为什么预交叉的连合轴突被 Shh 吸引，而 iRGC 轴突被 Shh 排斥的分子机制，以及 Numb/Nbl 是否还调节其他轴突导向受体的运输等问题，这些都有待进一步研究。
