构建前沿：人 MAPT 敲入小鼠模型，开启额颞叶痴呆研究新征程

本文构建了携带三个致病突变的人MAPT敲入（KI）小鼠模型。MAPTP301S;Int10+3;S320F小鼠在 6 月龄前出现 tau 病理变化，伴有突触丢失、脑萎缩和额颞叶痴呆（FTD）样行为。该模型为研究 FTD 及相关 tau 病变机制和药物筛选提供了有力工具。

　　### 构建携带三个 FTD 致病突变的突变MAPT KI 小鼠
额颞叶痴呆（FTD）等神经退行性疾病的一个重要特征是病理性 tau 蛋白的积累。此前的小鼠模型多依赖人工过表达突变 tau 蛋白，无法完全模拟疾病病理。为解决这一问题，研究人员利用胞嘧啶碱基编辑器（BE），在先前构建的携带 FTD 致病突变的人MAPT敲入小鼠基础上，设计靶向 S320 位置的单导向 RNA（sgRNA），引入 S320F 突变，成功获得了MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}、MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}等新的三突变小鼠品系，并通过多轮回交获得了纯合子小鼠。经全基因组重测序数据的in silico同源性分析，确认无潜在脱靶突变。

三突变MAPT KI 小鼠中 tau 异构体的表达模式

研究人员对各小鼠品系大脑皮质匀浆进行去磷酸化处理后，开展蛋白质免疫印迹分析。结果显示，MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}小鼠中 3R tau 的表达无法检测到，而MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠能产生少量可检测的 3R tau，尤其是 0N3R 异构体。相应地，MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}小鼠中 4R tau 高度表达，MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠表达的 4R tau 也远多于 3R tau。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析结果与之相符，表明 10+3 G>A 内含子突变影响可变剪接，使 tau 从 3R 向 4R 转变，S305N 突变进一步强化了这一效应。

AT8 阳性磷酸化 tau 积累的时空图谱

研究人员使用 AT8 抗体对小鼠不同冠状切片进行免疫荧光染色，以探究磷酸化 tau 的分布情况。热图显示，6 月龄的MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠在下丘脑和杏仁核中 tau 病理最强，躯体感觉和听觉皮层以及海马体中的强度相对较弱，梨状皮层和丘脑也有较强的 AT8 阳性信号。MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}小鼠的 AT8 阳性信号模式与之相似，但强度较低。MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠中磷酸化 tau 的积累随年龄增长而增加，推测 tau 积累可能在 4 - 5 月龄甚至更早开始，尤其是在下丘脑。

使用多种 tau 抗体对 tau 病理进行组织学研究

研究人员运用一系列识别 tau 蛋白磷酸化、寡聚化和病理构象结构的抗体，对三突变MAPT KI 小鼠品系进行免疫荧光分析。结果发现，MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠大脑中存在大量的超磷酸化和寡聚化 / 构象异常的 tau 蛋白，而MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}和MAPT^{S305N;Int10+3;S320Y}小鼠中的信号则较弱。此外，AT8 免疫反应性与 MAP2 和驱动蛋白免疫反应性共定位，表明磷酸化 tau 存在于神经元的树突、胞体和轴突中。

三突变MAPT KI 小鼠 tau 病理的生化分析

通过 Sarkosyl 分级分离法，研究人员从冷冻的丘脑 / 下丘脑脑组织中获得了 Tris 缓冲盐水（TBS）可溶性部分（S1，包含生理性 tau 形式）和 Sarkosyl 不溶性部分（P3，包含病理性 tau 形式）。蛋白质免疫印迹分析显示，虽然不同基因型小鼠的总 tau 表达量相当，但MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}和MAPT^{S305N;Int10+3;S320Y}小鼠中 tau 的磷酸化水平显著低于野生型人MAPT KI 小鼠。MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}和MAPT^{S305N;Int10+3;S320Y}小鼠的 P3 部分可检测到 Sarkosyl 不溶性磷酸化 tau，且MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠的 P3 部分含有 AT8 阳性的 Sarkosyl 不溶性 tau 物种，表明其 tau 具有高度寡聚化倾向。利用过表达含 P301S 突变的 tau 重复结构域的生物传感器细胞系进行实验，发现MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠的大脑裂解物能显著增加生物传感器细胞的种子活性，说明其存在与 12 月龄 PS19 品系相当的病理性种子活性构象的 tau。

神经炎症、突触损失和神经退行性变

神经炎症和突触损失是阿尔茨海默病（AD）和其他 tau 病变的病理标志。免疫组化分析显示，12 月龄的MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠中，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）显著上调，而离子钙结合衔接分子 1（Iba1）免疫反应性无明显变化，表明在该模型中，小胶质细胞增生与 tau 积累不成比例，二者关联较弱。超分辨率共聚焦显微镜分析发现，MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠下丘脑的突触前标记物突触素和突触后标记物 Homer1 的共定位显著减少，且其突触前蛋白 synaptophysin 和 synaptotagmin 的表达水平明显降低，而 PSD - 95 的表达量在各组间无差异，提示突触前膜比突触后膜更易受 tau 病理影响。Gallyas 银染色在 12 月龄MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠的下丘脑检测到阳性细胞，与 PS19 小鼠的结果一致，表明存在神经退行性变。磁共振成像（MRI）分析显示，MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}和MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠的下丘脑、杏仁核脑体积明显减小，MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠的海马体体积也显著降低，证实了 tau 病理导致的局部脑萎缩。

使用 IntelliCage 系统进行行为分析

IntelliCage 系统可自动分析群居小鼠的多种认知行为。研究人员利用该系统对MAPT（对照）、MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}和MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}三种小鼠进行行为分析，以评估其作为痴呆模型的有效性。结果显示，MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠在新环境中的舔舐次数显著减少，表明其焦虑水平升高；在 14 天内，该品系小鼠重新进入同一角落的百分比显著增加，表现出重复刻板行为；在学习和行为灵活性测试中，MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}和MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠在完成更复杂任务时需要更多试验次数，说明其学习和行为灵活性受损；在行为抑制和持续注意力测试中，MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠的反应时间延长，MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}小鼠在延长延迟时间后也出现反应延迟，且MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠的 “超时” 试验百分比显著增加，表明其持续注意力下降；在甜味偏好测试中，两种突变小鼠对甜味的感知正常，但在努力选择测试中，当获取奖励需要更多努力时，它们对糖精水的偏好显著降低，表现出类似冷漠的特质。此外，MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠体重增加，可能与食物摄入增加或代谢异常有关。

Aβ 沉积对MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠 tau 病理的影响

研究人员将App^{NL - G - F}小鼠与MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠杂交，得到App^{NL - G - F}×MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠，以研究 β - 淀粉样蛋白（Aβ）与 tau 的相互作用。结果发现，Aβ 斑块的存在显著增强了MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠大脑皮层和海马体中的 AT8 阳性信号，表明 tau 病理明显加重，但 Aβ 斑块密度未受影响，且App^{NL - G - F}和App^{NL - G - F}×MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠的 GFAP 和 Iba1 免疫信号无差异，说明神经炎症由 Aβ 斑块引发，与 tau 病理无关，即 Aβ 斑块可引导异常 tau 蛋白在海马体和皮层聚集，加速 tau 病理进程。

讨论

MAPT突变是 FTDP - 17 的病因，但不是 AD 的病因。然而，MAPT^{P301S;Int10+3}小鼠与App^{NL - G - F}小鼠杂交后，出现的 Aβ 沉积依赖性 tau 病理变化，证明了 Aβ 与 tau 病理之间存在明显的因果关系。本研究中的突变MAPT KI 小鼠高度适用于 FTDP - 17 和 AD 的临床前研究，因为 Aβ 沉积使MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠海马体和皮层的 tau 病理从 6 月龄就显著增加，这些双基因小鼠可模拟衰老人类大脑中的 Aβ - tau 轴。与MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠相比，缺乏 S320F 突变的MAPT^{P301S;Int10+3}小鼠在 24 月龄前 tau 病理变化极小，表明 P301S 和 S320F 突变协同影响 tau 蛋白的寡聚状态。该突变MAPT KI 小鼠模型不受过表达相关表型的影响，有助于在体内观察 tau 病理变化，且其稳定可重复的体内表型有利于研究 tau 病变的发病机制。虽然MAPT^{S305N;Int10+3}小鼠存在 tau 超磷酸化、突触损失和行为异常，而MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}和MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}小鼠虽未出现 tau 超磷酸化，但仍有局部脑萎缩和行为异常，这表明 tau 介导的毒性可能涉及不同的途径。MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}小鼠表现出的类似 FTD 的行为，使其比传统 tau 转基因小鼠更适合模拟 FTD 的临床症状和测试治疗策略。针对 Aβ 的免疫疗法在 AD 临床试验中的部分成功，提示针对病理性 tau 的免疫疗法可能对 FTDP - 17、AD 和其他 tau 病变有效，本研究的小鼠模型有助于确定可靶向的毒性 tau 物种，推动免疫疗法的发展。此外，这些突变小鼠在细胞生物学领域也有潜在应用，如建立胚胎干细胞（ESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs），用于体外药物筛选等。

研究的局限性

本研究使用的三突变组合在临床人类病例中并不存在，模型小鼠具有一定的人工性，但这是在避免过表达假象的情况下重现病理表型的有效方法。同时，研究未对携带 P301S/S305N 和 S320F 突变的 tau 原纤维的蛋白质结构进行检测，后续需进一步研究这些模型中积累的 tau 是否与 FTD 患者的病理性 tau 结构一致。

资源可用性

如需信息和资源，可联系主要联系人 Takaomi Saido（[e-mail]）。本研究生成和分析的数据集可向相应作者合理索取。所有独特 / 稳定的试剂，包括突变小鼠品系，可在签署材料转移协议后从主要联系人处获取。全基因组重测序数据可在 SRA（NCBI）获取，登录号分别为 SAMN46105978（MAPT^{P301S;Int10+3;S320F}）、SAMN46105979（MAPT^{S305N;Int10+3;S320F}）和 SAMN46105980（MAPT^{S305N;Int10+3;S320Y}），项目登录号为 PRJNA1152251。