靶向Rho GEFs的新型抑制剂GL-V9通过调控肌成纤维细胞活化和巨噬细胞重编程缓解肺纤维化

编辑推荐：针对特发性肺纤维化(IPF)现有疗法疗效有限的难题，中国药科大学团队发现新型黄酮衍生物GL-V9通过特异性结合Rho GEFs的DH/PH结构域，阻断RhoA/ROCK信号通路，同时抑制肌成纤维细胞活化和M2型巨噬细胞极化，在动物模型中显著改善博来霉素诱导的肺纤维化，为靶向"不可成药"的Rho GTPase通路提供了新策略。

　　

肺纤维化被称为"不是癌症的癌症"，特发性肺纤维化(IPF)患者确诊后的中位生存期仅3-5年。现有药物尼达尼布和吡非尼酮仅能延缓疾病进展，且面临耐药问题。这种致命疾病的根源在于反复肺泡上皮损伤引发的异常修复过程——肌成纤维细胞过度活化产生大量细胞外基质(ECM)，同时M2型巨噬细胞持续分泌促纤维化因子，形成不可逆的肺组织瘢痕。其中Rho GTPases家族作为细胞骨架重组的关键调控者，虽被公认与纤维化密切相关，却因球形蛋白结构缺乏药物结合位点，长期被视为"不可成药"靶点。

中国药科大学魏利斌团队在《Cell Death and Disease》发表的研究突破性地发现，新型黄酮衍生物GL-V9能精准靶向Rho鸟苷酸交换因子(Rho GEFs)的DH/PH结构域，通过双重机制缓解肺纤维化：一方面抑制肌成纤维细胞活化，另一方面重编程促纤维化巨噬细胞。研究采用博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，结合RNA测序、分子对接、表面等离子共振(SPR)和荧光共振能量转移(FRET)等技术，系统解析了GL-V9的作用机制。

关键技术方法包括：建立博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，分预防性(造模当天)和治疗性(造模第7天)两种给药策略；通过RNA-seq分析GL-V9对肌成纤维细胞转录组的影响；采用分子对接和SPR验证GL-V9与LARG蛋白DH/PH结构域的结合；利用GST pull-down和FRET biosensor检测RhoA活性；构建组成型激活RhoA(CA RhoA)突变体进行功能回复实验。

研究结果部分显示：

1. GL-V9减轻小鼠肺纤维化：在两种给药策略下，GL-V9均显著改善小鼠生存率，降低肺组织湿重，减少胶原沉积和α-SMA⁺肌成纤维细胞数量，病理评分显示纤维化面积减少，且与一线药物尼达尼布疗效相当。
2. GL-V9抑制M2巨噬细胞极化：通过流式细胞术发现GL-V9降低支气管肺泡灌洗液(BALF)中F4/80⁺CD206⁺细胞比例，免疫组化显示肺泡间隔CD206⁺巨噬细胞浸润减少，同时降低TGF-β1分泌。
3. GL-V9靶向Rho GEFs的分子机制：分子对接发现GL-V9与LARG的DH/PH结构域ARG922、LEU924和LYS939形成氢键，SPR测定结合亲和力K_d=11.84μM。突变实验证实ARG922是关键结合位点，GL-V9能干扰RhoGEF与RhoA的结合。
4. GL-V9抑制肌成纤维细胞活化：通过RhoA2G生物传感器发现GL-V9降低TGF-β1诱导的RhoA-GTP水平，减少肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化，破坏F-actin应力纤维和黏着斑形成。RNA-seq显示GL-V9下调ECM相关基因表达。
5. 调控MRTF/YAP信号：GL-V9促进MRTF-A滞留胞增加YAP磷酸化并抑制其核转位，双荧光素酶报告基因显示TEAD转录活性降低。在CA RhoA表达的细胞中，GL-V9对细胞骨架和YAP的调控作用被逆转。
6. 阻断RhoA-STAT3通路：GL-V9抑制IL-4STAT3磷酸化，在CA RhoA表达的RAW264.7细胞中，GL-V9对M2标志物Arg1的抑制作用消失，STAT3抑制剂C188-9可模拟GL-V9效应。

结论与讨论部分指出，该研究首次揭示靶向Rho GEFs的小分子抑制剂可通过双重机制缓解肺纤维化：通过抑制RhoA/ROCK通路，干扰肌成纤维细胞的细胞骨架重组和MRTF/YAP转录活性；同时阻断RhoA-STAT3轴抑制M2巨噬细胞极化。特别值得注意的是，GL-V9对已形成的纤维化仍显示治疗效果，且能抵抗溶血磷脂酸(LPA)的促纤维化作用。该研究不仅为IPF治疗提供了候选药物，更通过靶向Rho GEFs破解了Rho GTPase"不可成药"的困境，为相关纤维化疾病治疗开辟了新途径。未来研究可进一步优化GL-V9的药代动力学特性，并探索其在其他器官纤维化中的应用价值。