质子感应GPCR激活的逐步结构基础：GPR4与GPR65的分子机制解析

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在生命活动中，酸碱平衡的精密调控如同交响乐团的指挥棒，而质子感应G蛋白偶联受体（GPCRs）就是其中最敏锐的"pH传感器"。GPR4、GPR65和GPR68这组受体能感知细胞外质子浓度变化，在血管生成、免疫调节和肿瘤转移等过程中扮演关键角色。然而，这些受体如何将pH变化转化为细胞信号？为何不同受体偏好不同的G蛋白信号通路？这些核心问题长期困扰着科学家。更棘手的是，这类受体缺乏三维结构信息，导致靶向药物开发举步维艰。中国科学院的研究团队在《Cell Research》发表的研究，通过冷冻电镜技术首次捕捉到质子感应GPCRs的"分子快照"，揭开了这个长达二十年的科学谜团。

研究采用冷冻电镜单颗粒分析技术，在不同pH条件下解析了GPR4与G_s/G_q/G₁₃蛋白的复合物结构，分辨率达到2.7-3.4 ?。通过构建NE52-QQ57结合的GPR4非活性结构，结合突变分析、分子动力学模拟和脂质组学检测，系统研究了质子感应与受体激活的分子机制。样本来源于昆虫细胞表达系统，通过优化构建体（如N端融合内切葡聚糖酶H蛋白）提高表达量。

"结构基础"部分揭示了GPR4的独特特征：胞外区存在两对二硫键（C90^3.25-C168^ECL2和C9^N-term-C258^7.25），其中后者为GPR4特有。pH6.8-GPR4-G_s结构显示，ECL2形成典型的β-折叠发夹构象，而在pH8.0的中间态结构中，ECL2呈现水平短环构象。关键发现是：破坏任何一对二硫键都会显著削弱受体对质子的响应能力。

"G_q或G₁₃偶联的GPR4复合物结构"部分意外捕获了两种构象状态：pH7.5-GPR4-G_q-state-1具有典型活性构象，而state-2则呈现"混合态"——胞内区激活但胞外区部分失活。质谱分析发现活性结构中存在溶血磷脂酰胆碱（LPC 16:1）的结合，提示脂质分子可能参与调控。

"NE52-QQ57在GPR4中的变构结合模式"展示了该拮抗剂结合在TM1-3和TM7形成的独特口袋中，其双环核心与W73^2.60、F97^3.32形成π-π堆积，哌啶基团则与H269^7.36相互作用。关键突变实验证实W73^2.60和Y24^1.39对拮抗剂活性至关重要。

"GPR4的质子感应机制"部分阐明了关键组氨酸网络：H165^ECL2和H269^7.36构成双传感器系统。在pH6.8的活性结构中，质子化的H269^7.36与E170^ECL2、D161^3.31形成氢键网络，而H165^ECL2则与D81^ECL1、D161^ECL2相互作用。双重突变H269^7.36F/H165^ECL2F几乎完全废除受体活性。

"逐步质子感应"模型提出：在初始激活阶段（pH7.5），仅H269^7.36被质子化；随着pH降低，ECL2构象变化使H165^ECL2加入感应网络，实现完全激活。这种"分步启动"机制解释了GPCRs对pH变化的梯度响应。

"GPR65-G_s复合物结构"显示其采用与GPR4不同的二硫键模式（C87^3.25-C170^ECL2和C5^N-term-C160^ECL2）。虽然整体结构与GPR4相似，但其胞外腔更宽松。关键质子感应残基H10^N-term与D8^N-term、D13^1.31形成网络，而R273^7.36（对应GPR4的H269^{7.36</sup）与D172ECL2相互作用。}

"G蛋白偶联模式"分析揭示了GPR4与不同G蛋白的特异性相互作用：G_s偶联时形成最大界面面积（1230 ?²），其α5螺旋上的E392/Y391与GPR4的Q45^1.60/E51^2.38形成极性接触；而G₁₃偶联模式与S1PR2-G₁₃结构相似，存在独特的"甲硫氨酸口袋"。

这项研究首次完整描绘了质子感应GPCRs的激活轨迹，提出了"组氨酸-羧酸网络的逐步激活"模型。其科学价值体现在三方面：首先，为理解GPCRs的pH依赖性激活提供了原子级蓝图；其次，发现的全新变构位点为开发靶向药物开辟了新途径；最后，揭示的G蛋白偶联特异性机制有助于设计偏向性配体。这些发现对治疗炎症性肠病、肿瘤微环境调控等pH相关疾病具有重要指导意义，标志着细胞环境感应机制研究迈入新阶段。