点击配体导向的模块化方法：在活细胞中标记内源性多巴胺 D1受体的新突破

为解决基于发光技术依赖基因改造受体过表达，无法特异性标记天然受体的问题，研究人员开展了点击配体导向（CLD）标记内源性多巴胺 D1受体的研究。结果显示该方法可标记转染细胞和神经细胞系中的 D1受体，且受体功能完整，为研究内源性 GPCRs 提供新工具。

　　在生命科学领域，G 蛋白偶联受体（GPCRs）是一类极为重要的膜蛋白超家族，它们广泛参与人体众多生理过程的调节，是约 35% 已批准药物的作用靶点。目前，基于发光的技术虽然能用于监测 GPCRs 的相关特性，但大多依赖于在异源细胞中过表达基因改造的受体。这种人工系统存在明显缺陷，改造后的受体特性与天然环境中的受体差异较大，无法真实反映其在体内的情况，而且在临床研究中分析人类样本时，天然受体的标记也至关重要。为了攻克这些难题，来自法国蒙彼利埃大学功能基因组学研究所、西班牙巴塞罗那科学研究委员会高级化学研究所等机构的研究人员开展了深入研究。他们致力于开发一种新方法，实现对天然受体的特异性标记，最终成功研发出点击配体导向标记（CLD）技术，并将其应用于内源性多巴胺 D₁受体的标记研究。该研究成果发表在《Communications Chemistry》上，为后续深入研究内源性 GPCRs 开辟了新道路。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是利用基于异质铜（I）催化的叠氮 - 炔环加成（CuAAC）化学构建 CLD 标记探针，通过模块化设计，将不同分子模块组合制备标记探针；二是采用功能和结合实验对相关化合物的药理学特性进行表征，如运用 HTRF? cAMP Gs Dynamic assay 和 Tag-Lite? assays 等实验技术；三是借助显微镜技术，包括宽场显微镜和共聚焦显微镜，对受体的标记和动态变化进行可视化观察。

研究结果

1. 方法设计与单元合成

研究人员以多巴胺 D₁受体为目标，选择酰基咪唑作为反应性部分，但由于 D₁受体配体的化学性质与酰基咪唑不兼容，所以采用 CLD 标记策略。他们设计并合成了多种分子模块，如带有炔基和咪唑的可点击连接子、含荧光染料的模块以及基于 D₁拮抗剂的亲和单元模块等。同时，通过分析 D₁受体的氨基酸序列和结构，确定了细胞外环 2（ECL2）上的赖氨酸 K165 和 K167 为潜在标记位点，并探索了不同长度的柔性 PEG 连接子。

2. 亲和单元的药理学表征

对可逆结合的类似物 4a - c 和 6a - b 进行药理学特性表征，结果表明所有测试配体均具有纳摩尔级的结合亲和力，且连接子长度与结合亲和力呈负相关。此外，各配体的停留时间相近，这意味着标记反应后短时间灌注即可洗去副产物 6，使受体结合位点保持可用。

3. 点击反应与受体标记

通过 CuAAC 点击反应制备最终的标记探针 5a - i，由于反应存在副反应，难以分离出高纯度的产物 5，因此直接使用反应混合物进行受体标记。实验优化了标记条件，发现 2 h 的孵育时间和微摩尔浓度的反应探针 5e 能获得最大特异性标记百分比。进一步研究确定了 Lys167 是标记反应的主要位点，且标记后的受体结合位点可与其他配体结合，功能不受影响。

4. D₁受体标记的可视化

利用宽场显微镜观察到，CLD 探针 5h 能特异性标记活细胞中的 D₁受体，在细胞膜上呈现出明显的荧光信号，且与细胞内荧光蛋白有高度共定位。在激动剂作用下，可观察到 CLD 标记的 HA - D₁受体发生内化，这表明标记后的受体功能正常。此外，研究还证实了该方法可有效标记内源性 D₁受体。
在结论与讨论部分，研究人员开发的 CLD 技术是一种模块化配体导向的化学标记技术，为标记内源性多巴胺 D₁受体提供了有效方法，也为标记其他胺能受体奠定了基础。尽管目前标记产率与成熟技术相比还有提升空间，但该技术无需基因工程即可克服内源性胺能 GPCRs 标记的难题。未来可通过优化反应条件、选择更合适的亲电物种或点击化学方法进一步改进。该技术能够可视化受体在细胞膜上的表达和动态变化，为研究内源性 GPCRs 提供了有力工具，在原生 GPCR 研究领域具有广阔的应用前景，有望推动相关疾病的研究和治疗发展。