Phenocycler 2.0?多重成像技术解析小鼠骨髓微环境：突破传统技术限制的空间组学新策略

本刊推荐：骨髓(BM)微环境研究长期受限于传统流式细胞术和免疫荧光(IF)技术无法同时保留空间信息与多标记检测的难题。印第安纳大学团队创新性采用Phenocycler 2.0? CODEX技术结合HALO 4.0?分析软件，建立首个适用于小鼠BM cryosection的多重成像方案。该研究成功实现40+标记同步检测，精准定位造血干细胞(HSCs)、巨核细胞(MKs)等稀有细胞的空间分布，为血液病机制研究提供全新维度工具。成果发表于《Leukemia》DOI:10.1038/s41375-025-02596-5

　　

在生命科学领域，骨髓(BM)这个神秘的"造血工厂"始终充满未解之谜。这个被坚硬骨骼包裹的凝胶状组织，包含着造血干细胞(HSCs)、巨核细胞(MKs)等特殊细胞群体，它们通过精密的空间排列和分子对话维持着机体造血功能。然而研究者们长期面临一个技术困境：传统流式细胞术需要解离组织导致空间信息丢失，而免疫荧光(IF)又受限于光谱重叠只能检测3-8个标记。这种"见林不见树"或"见树不见林"的窘境，严重阻碍了对BM复杂微环境的解析，特别是在研究白血病等血液疾病时，难以揭示稀有细胞群体的三维生态位特征。

针对这一挑战，印第安纳大学Simon综合癌症中心的Sonali J. Karnik等研究者创新性地将Phenocycler 2.0?多重成像平台应用于小鼠BM研究。这项发表于《Leukemia》的工作，通过共检测索引(CODEX)技术结合优化的图像处理流程，首次实现40余种细胞/结构标记的同时检测，分辨率达到单细胞水平。研究团队特别针对BM组织特性开发了全套实验方案：采用甲醇:丙酮(1:1)固定减少自发荧光，优化cryosection厚度至10μm，创新性引入"预处理空白"和交错空白循环策略，显著提升CD117等稀有标记的信噪比。通过HALO 4.0?软件分析，不仅验证了与流式细胞术90%的相关性，更首次可视化LSK细胞(Lineage^-Sca1⁺c-kit⁺)等原始祖细胞的空间分布特征。

关键技术方法包括：1) 建立基于CODEX原理的40标记抗体panel，通过Atto550/AlexaFluor^TM 647/750三通道分配策略优化信号检测；2) 对比三种固定方法确定甲醇:丙酮最佳；3) 开发新型背景扣除算法处理.raw.qptiff文件；4) 使用PF4Cre;iDTR小鼠模型验证MKs特异性消融；5) HALO软件进行空间定量分析。所有实验采用12-14周龄C57BL/6J雄性小鼠。

研究结果部分，《骨髓微环境多重成像》展示了技术突破：通过比较Cell-Tak^TM与硅烷载玻片，发现前者能更好保留骨骼肌等相邻组织，而后者更适合纯BM研究。《野生型与MK消融模型对比》章节中，使用PF4Cre;iDTR模型证实100 ng/mL白喉毒素(DT)可特异性清除CD41⁺ MKs群体，为血小板疾病研究提供新工具。《原始祖细胞空间定位》则首次在完整组织中识别出LSK、CMP(常见髓系祖细胞)和CLP(常见淋巴祖细胞)的三维分布，发现Lin^-群体更倾向于血管。

《结构标记图谱》揭示了BM微环境的复杂构成：Endomucin⁺窦状血管与SCA1⁺动脉形成立体网络，Fibulin2等ECM蛋白构成特殊的干细胞niche。值得注意的是，研究者发现传统灌注法会破坏BM血管结构，而直接固定能更好保留组织结构完整性。《技术对比验证》通过回归分析证实，CD45等标记的细胞比例与流式结果高度一致(r=0.9)，但CD41⁺ MKs因多倍体核特性需要特殊分析算法。

在结论与讨论部分，研究者强调这项技术突破的多重意义：首先，建立的标准化流程使BM空间组学研究成为可能，特别是对占比仅0.01-0.02%的HSCs研究具有革命性意义；其次，发现的结构标记如Lumican、Emilin2等为理解造血niche提供新线索；最后，技术可拓展性体现在：1) 组织可重复使用于H&E染色等后续分析 2) 适用于基因研究。尽管存在自发荧光颗粒干扰等技术局限，但该方法为白血病微环境、骨髓纤维化等疾病机制研究开辟了新途径。正如通讯作者Reuben Kapur和Melissa A. Kacena指出，这种"细胞社会学"研究范式将深刻改变我们对造血系统空间调控的认知。