CaMK2A/CREB 通路激活：糖尿病视网膜病变中神经元凋亡与线粒体自噬的 “推手” 及潜在治疗新靶点

本文聚焦糖尿病视网膜病变（DR），研究发现 CaMK2A/CREB 信号通路激活与 DR 中增强的线粒体自噬（mitophagy）和神经元凋亡相关。通过体内外实验，揭示其作用机制，为 DR 神经保护治疗提供潜在靶点，对理解 DR 发病机制和开发新疗法意义重大。

　　### 研究背景
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病常见的微血管并发症，也是全球范围内导致视力丧失和失明的主要原因之一。其发病机制涉及进行性神经退行性变，尤其是多巴胺能神经元的丢失，这些神经元在调节视网膜功能和视觉处理中起着关键作用。目前 DR 的治疗策略主要集中在控制高血糖和针对血管异常，但仍需要有效的神经保护疗法来维持视网膜神经元功能。

Ca²⁺/ 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IIα（CaMK2A）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）信号通路与多种神经系统疾病有关。CaMK2A 是一种多功能丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在调节神经元信号传导、可塑性和存活方面至关重要；激活后的 CaMK2A 可磷酸化并激活 CREB，CREB 作为转录因子，能调控与神经元存活、突触可塑性和神经发生相关基因的表达。同时，线粒体功能障碍和线粒体质量控制机制（如自噬和线粒体自噬）受损也与 DR 的发病机制有关。适度的自噬和线粒体自噬对维持细胞稳态很重要，但过度或失调的线粒体自噬会导致线粒体过度降解，影响能量产生并促进神经元细胞死亡。本研究旨在探讨 CaMK2A/CREB 信号通路在 DR 发病机制中的作用，以及其与线粒体自噬和神经元变性的相互关系，并探索靶向该通路作为治疗 DR 的策略。

材料和方法

1. 动物和 DR 模型诱导：选用 8 - 10 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠，在温度（22 ± 2℃）和光照（12 小时光 / 暗循环）可控的环境中饲养，自由进食和饮水。所有动物实验均获得昆明医科大学机构动物护理和使用委员会伦理审查委员会批准（批准号：kmmu20241516）。通过连续 5 天腹腔注射链脲佐菌素（STZ，60mg/kg 体重）诱导 DR 模型，以注射柠檬酸盐缓冲液的同年龄、同性别的小鼠作为对照组。血糖水平连续 5 天高于 16.7mmol/L 的小鼠被认为患有糖尿病。多巴胺 / 卡比多巴组的糖尿病小鼠从糖尿病发病开始，每天腹腔注射盐酸多巴胺（10mg/kg/ 天）和卡比多巴（2.5mg/kg/ 天），持续 4 周，卡比多巴用于抑制外周多巴胺脱羧，增强其在视网膜组织中的生物利用度。将携带 CaMK2A 短发夹 RNA（sh - CaMK2A）或对照短发夹 RNA（sh - NC）的慢病毒颗粒玻璃体腔内注射到 DR 小鼠眼中。4 周后，处死小鼠收集视网膜组织进行组织学分析和分子检测。
2. 细胞培养和处理：原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）在含有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 - 链霉素的专用培养基中培养，置于 37℃、5% CO₂的湿润环境中。通过两步免疫筛选法分离原代 RGCs，并经供应商鉴定表达 RGC 特异性标记物（Brn3a、RBPMS 和 Thy1.2）。高糖（HG）处理时，细胞暴露于 30mM D - 葡萄糖中 48 小时。使用自噬抑制剂 3 - 甲基腺嘌呤（3 - MA，5mM）抑制自噬，用 CREB 激活剂福司柯林（10μM）和 CREB 磷酸化抑制剂 666 - 15（10μM）调节 CREB 活性。
3. siRNA 转染：按照制造商说明，使用 Lipofectamine RNAiMAX 试剂将 CaMK2A 小干扰 RNA（siCaMK2A）和对照小干扰 RNA（siControl）转染到 RGCs 中，转染 48 小时后进行后续实验。
4. 其他实验方法：利用透射电子显微镜（TEM）观察视网膜组织或 RGCs 的线粒体自噬情况；通过蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测相关蛋白表达水平；使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测视网膜组织或细胞培养上清液中的多巴胺、3,4 - 二羟基苯乙酸（DOPAC）以及视网膜组织中的白细胞介素 - 1β（IL - 1β）、肿瘤坏死因子 - α（TNF - α）和白细胞介素 - 6（IL - 6）水平；采用活性氧（ROS）检测试剂盒测量组织裂解物中的 ROS 浓度；通过 Annexin V - FITC 凋亡检测试剂盒和流式细胞术分析细胞凋亡；利用 EdU 掺入实验评估细胞增殖；使用 CREB 转录因子检测试剂盒测定 CREB 转录活性。数据以平均值 ± 标准差（SD）表示，采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，多组比较采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），并进行 Tukey 事后检验，p < 0.05 认为具有统计学意义。

结果

1. 糖尿病视网膜病变与增强的线粒体自噬和 CaMK2A/CREB 通路激活相关：通过 STZ 诱导建立 DR 小鼠模型，4 周后进行检测。H&E 染色显示 DR 模型组视网膜不同层细胞发生变性，视网膜厚度量化结果表明模型组出现视网膜病变，细胞凋亡分析显示模型组视网膜组织细胞死亡增加，ELISA 检测发现 DR 组织中神经递质（多巴胺和 DOPAC）产生减少，这些结果证实 DR 模型诱导成功。TEM 分析显示 DR 组织中线粒体易被自噬体膜包裹，与线粒体自噬相关的蛋白（LCBII、Parkin、PINK1）表达增加，线粒体分裂关键调节蛋白 Drp1 也上调，而线粒体融合关键调节蛋白 Mfn2 的蛋白水平在对照组和 DR 模型组中无明显差异。同时，DR 组织中 CaMK2A 蛋白水平增加，CREB 磷酸化增强。
2. 高糖诱导视网膜神经节细胞线粒体自噬并促进 CaMK2A/CREB 通路激活：在 RGCs 中应用高糖处理，并设置自噬抑制剂 3 - MA 处理组作为对照。TEM 显示 3 - MA 抑制了高糖诱导的线粒体自噬，蛋白质免疫印迹结果表明高糖诱导的线粒体自噬标记物（LCBII、Parkin、PINK1）和 Drp1 蛋白上调被 3 - MA 减弱。EdU 掺入实验显示高糖抑制细胞增殖，3 - MA 部分挽救了这一效应，同时 3 - MA 也减轻了高糖诱导的 RGCs 细胞死亡。然而，3 - MA 未能抑制高糖诱导的 CaMK2A 表达增加和 CREB 磷酸化，CREB 转录活性检测也表明自噬抑制剂在高糖条件下不能降低 CREB 依赖的 DNA 结合。此外，3 - MA 处理促进了高糖诱导后 RGCs 中多巴胺和 DOPAC 的产生。
3. CaMK2A 敲低减少高糖诱导的 RGCs 中 CREB 磷酸化和线粒体自噬：在高糖条件下，应用 siRNA 靶向 CaMK2A 抑制其表达，并设置福司柯林处理组。结果显示，CaMK2A 沉默降低了 CREB 磷酸化，福司柯林可使其重新激活，同时福司柯林增加了 CaMK2A 沉默后的 CREB 转录活性，表明 CaMK2A 是 CREB 磷酸化的正调节因子。CaMK2A 沉默抑制了高糖诱导的线粒体自噬标记物（LCBII、Parkin、PINK1）和 Drp1 蛋白上调，福司柯林可逆转这一作用。TEM 分析表明 CaMK2A 敲低抑制了高糖诱导的线粒体自噬，福司柯林重新激活 CREB 后促进了线粒体自噬。EdU 实验显示 CaMK2A 沉默部分挽救了高糖条件下的细胞分裂，福司柯林处理取消了这一挽救作用，同时福司柯林也取消了 CaMK2A 沉默对细胞凋亡和多巴胺 / DOPAC 产生的挽救作用。
4. 抑制 CREB 磷酸化对高糖诱导的线粒体自噬和细胞死亡有挽救作用：在高糖诱导条件下，应用 CREB 激活剂福司柯林和 CREB 磷酸化抑制剂 666 - 15 处理 RGCs。结果显示，福司柯林进一步增加 CREB 磷酸化，666 - 15 则相反，且这两种化学物质不影响 CaMK2A 蛋白水平。CREB 转录活性检测表明福司柯林增强了 CREB 依赖的 DNA 结合，666 - 15 则降低了其结合。蛋白质免疫印迹分析显示福司柯林增强了高糖诱导的线粒体自噬标记物（LCBII、Parkin、PINK1）和 Drp1 蛋白上调，666 - 15 则抑制了它们的上调。TEM 观察到高糖 + 福司柯林条件下线粒体自噬增加，666 - 15 减弱了高糖诱导的线粒体自噬。EdU 实验表明福司柯林进一步抑制了高糖条件下的细胞分裂，666 - 15 则有挽救作用。在细胞凋亡方面，福司柯林有加重作用，666 - 15 有保护作用，并且细胞存活情况与多巴胺和 DOPAC 的产生相关。
5. 靶向 CaMK2A 抑制线粒体自噬和 DR 进展：在糖尿病发病后，将携带对照 shRNA（sh - NC）或 CaMK2A shRNA 的慢病毒应用于 DR 模型小鼠，以多巴胺 / 卡比多巴给药作为阳性对照组。结果显示，CaMK2A 沉默与多巴胺 / 卡比多巴处理类似，减轻了 DR 病变，增加了视网膜厚度，流式细胞术分析证明了 CaMK2A 沉默对视网膜细胞死亡的保护作用。CaMK2A 敲低增加了视网膜组织中多巴胺和 DOPAC 的水平，减弱了 CREB 磷酸化，且多巴胺给药也减弱了 DR 组织中 CaMK2A/CREB 通路，提示多巴胺与 CaMK2A/CREB 通路之间存在反馈调节。免疫印迹和 TEM 分析表明 CaMK2A 敲低或多巴胺给药均抑制了 DR 组织中的线粒体自噬，阻止了线粒体自噬标记物（LCBII、Parkin、PINK1）和 Drp1 的上调。
6. 靶向 CaMK2A 减轻 DR 模型视网膜组织的氧化应激、炎症和神经元损失：对视网膜组织的氧化应激、炎症细胞因子和不同神经元细胞进行评估。ROS 测量显示 CaMK2A 敲低或多巴胺 / 卡比多巴处理后 DR 组织中的氧化应激降低，同时这两种处理也减弱了 DR 组织中炎症细胞因子（IL - 1β、TNF - α 和 IL - 6）的产生。流式细胞术分析表明 CaMK2A 敲低或多巴胺 / 卡比多巴处理抑制了视网膜组织中 Iba1⁺CD68⁺小胶质细胞的激活，对 Brn - 3a⁺ISL1⁺视网膜神经节细胞和 PKCα⁺CD15⁺视网膜双极细胞的检测进一步揭示了 CaMK2A 敲低或多巴胺 / 卡比多巴处理对 DR 模型中神经元细胞损失的保护作用。

讨论

本研究表明，失调的 CaMK2A/CREB 信号可能导致 DR 中过度的线粒体自噬和随后的神经元变性。高血糖诱导 CaMK2A 激活和 CREB 磷酸化，引发过度的线粒体自噬。调节 CaMK2A/CREB 通路或抑制自噬可在体外和体内抑制高糖诱导的神经元细胞死亡。这凸显了维持视网膜神经元线粒体自噬和线粒体生物发生之间平衡的重要性，并确定 CaMK2A/CREB 通路是 DR 神经保护的潜在治疗靶点。

以往研究表明，糖尿病的高血糖状态会过度刺激自噬，对靶器官造成损害。在 DR 中，神经元过度激活自噬会导致视网膜神经细胞凋亡增加，抑制自噬水平可减轻高血糖毒性并增强视网膜功能。动物实验也发现，糖尿病相关认知障碍与过度的自噬激活有关，减轻这种活动可改善认知能力。这些都与本研究中高血糖诱导的自噬会损害神经元功能的结果一致，且本研究进一步表明 DR 中过度的自噬可能通过破坏视网膜神经元的线粒体稳态来损害视网膜功能。

自噬和线粒体自噬在神经元存活中的作用复杂且依赖于具体情况。适度的线粒体自噬对维持线粒体质量控制和细胞稳态至关重要，但过度或失调的线粒体自噬对神经元功能和视网膜细胞有害。本研究发现，DR 中的高糖条件使线粒体自噬失衡，导致视网膜神经元线粒体耗竭，且这种失衡可能因其他 DR 相关因素（如氧化应激和炎症）而加剧，进一步损害线粒体功能并促进神经元细胞死亡。

CaMK2A 介导的信号与多种糖尿病并发症有关，包括视网膜血管和神经元异常。先前研究表明，糖尿病小鼠视网膜中 CaMK2A 活性增加，导致周细胞丢失和血管渗漏，而基因敲除 CaMK2A 或药物抑制其活性可改善糖尿病诱导的视网膜血管功能障碍和炎症。本研究进一步揭示 CaMK2A/CREB 信号在调节 DR 中的线粒体自噬和神经元存活方面也起着关键作用，该通路失调导致过度的线粒体自噬，最终导致多巴胺能神经元变性，这是 DR 的一个关键病理特征。

CREB 作为转录因子，介导与神经元发育、突触可塑性和神经保护相关基因的表达。在视网膜中，CaMKII 介导的 CREB 信号与视网膜神经节细胞（RGC）存活调节有关。本研究发现高糖条件导致 CaMK2A/CREB 通路异常激活，表明该通路过度激活对视网膜细胞有害。已有研究显示，CREB 在不同细胞环境中参与调节自噬，如法尼醇 X 受体（FXR）通过 CREB 依赖机制诱导自噬，雷帕霉素在新生儿缺氧缺血模型中通过 Akt/CREB 信号通路激活自噬，硫代乙酰胺在阿尔茨海默病动物模型中促进 CREB 介导的自噬。在本研究中，沉默 CaMK2A/CREB 通路通过减弱视网膜组织中的线粒体自噬减轻了 DR 病变，为改善 DR 进展提供了新的靶点。

本研究也存在一些局限性。首先，虽然发现 CaMK2A/CREB 通路激活与 DR 中增强的线粒体自噬密切相关，但两者之间精确的分子机制尚未完全阐明，未来需要利用分子相互作用方法和通路特异性干预来确定 CaMK2A/CREB 信号是直接调节线粒体自噬还是通过中间通路起作用。其次，本研究主要集中在视网膜神经节细胞，CaMK2A/CREB 通路调节对其他视网膜细胞类型的影响还需进一步研究。最后，虽然短期干预显示出有前景的结果，但在考虑临床转化之前，还需要对 CaMK2A 通路抑制在 DR 治疗中的长期安全性和有效性进行研究。

结论

综上所述，本研究揭示了 DR 中失调的 CaMK2A/CREB 信号通路、过度的线粒体自噬和多巴胺能神经元变性之间的新机制联系。高糖条件导致 CaMK2A/CREB 通路异常激活，促进过度的线粒体自噬，破坏线粒体稳态，最终导致神经元细胞死亡。这些发现表明 CaMK2A/CREB 通路是 DR 神经保护干预的潜在治疗靶点。未来研究应探索 CaMK2A/CREB 信号对线粒体自噬和神经元存活的细胞类型特异性影响，为 DR 和其他神经退行性疾病的更有针对性的治疗方法奠定基础。