植物细胞分裂素运输机制的关键突破：拟南芥 AZG2 的结构与功能解析

为探究细胞分裂素（cytokinins）运输机制，研究人员以拟南芥 AZG2 为研究对象，开展其对细胞分裂素和嘌呤运输的研究。结果发现了 AZG2 在不同 pH 下的底物结合和运输特性，明确了其结构动态变化。这为理解植物细胞分裂素运输机制提供了关键依据。

　　在植物的生长发育过程中，细胞分裂素（cytokinins）扮演着极为重要的角色，它是一类腺嘌呤衍生物植物激素，对植物的生长、发育以及应对环境因素的变化起着关键的调控作用。从促进芽和根的生长，到影响叶片的发育与衰老、种子的萌发，再到参与营养代谢以及应对干旱、盐碱和温度等环境胁迫，细胞分裂素无处不在。然而，细胞分裂素发挥功能的一个关键环节 —— 运输过程，却存在诸多未知。

细胞分裂素的运输过程决定了其在植物体内的空间分布，而这种分布又对其功能的发挥至关重要。不同类型的细胞分裂素，如异戊烯基腺嘌呤（iP）和反式玉米素（tZ），有着不同的生物合成位点和运输方向 。tZ 主要在根部合成，通过木质部向地上部分运输；iP 则在地上部分产生，向根部运输。不仅如此，细胞分裂素的短距离运输，包括细胞间和细胞内的移动，也在其信号传导中发挥着重要作用。

目前，虽然已经知道多个转运蛋白家族参与细胞分裂素的运输，包括 ATP 结合盒（ABC）家族、平衡核苷（ENT）家族、嘌呤通透酶（PUP）家族、糖最终输出转运蛋白（SWEET）家族以及 AZA - 鸟嘌呤抗性（AZG）家族转运蛋白等，但对于这些转运蛋白的具体作用机制，尤其是 AZG 家族中 AZG2 介导的嘌呤和细胞分裂素运输过程，以及其与同家族其他成员（如 AZG1）在运输机制上的差异，仍有待进一步深入研究。

为了深入探索这些问题，中国科学技术大学的研究人员开展了一系列研究。他们以拟南芥中的 AZG2 为研究对象，深入探究其对细胞分裂素和嘌呤的运输机制。研究成果发表在《Nature Communications》上，为揭示植物细胞分裂素运输的分子机制提供了重要依据。

研究人员在该研究中运用了多种关键技术方法。在细胞水平，通过人胚肾 293F（HEK293F）细胞为基础的运输测定系统，来研究 AZG1 和 AZG2 对嘌呤和细胞分裂素的运输特性。在蛋白质结构研究方面，利用冷冻电镜（cryo - EM）单颗粒分析技术，测定 AZG2 在不同状态下的结构。同时，运用等温滴定量热法（ITC）来确定 AZG2 与底物的结合亲和力。

下面详细介绍研究结果：

1. AZG2 的底物结合和运输特性：通过细胞运输实验，研究人员发现，在 pH 5.5 的细胞外缓冲液中，表达 AZG1 或 AZG2 的细胞比表达空载体的对照细胞积累更多的 [3H] - 腺嘌呤或 [3H] - tZ，且 AZG2 积累的放射性标记底物比 AZG1 更多。进一步测定 AZG2 的底物饱和运输动力学，得到其运输 [3H] - 腺嘌呤和 [3H] - tZ 的 V_max 分别为 259.4 ± 12.6 和 88.0 ± 3.6 pmol/min per 10? cells，K_m值分别为 1.02 ± 0.16 和 0.73 ± 0.09 μM 。在不同 pH 条件下的实验表明，质子梯度能够促进 AZG2 对腺嘌呤和 tZ 的运输 。此外，通过竞争实验发现，AZG2 能够识别多种类型的细胞分裂素，包括 iP、苄基腺嘌呤（BA）和激动素等，但不能识别细胞分裂素前体反式玉米素核苷（tZR）。利用 ITC 测定结合亲和力发现，酸性 pH 增强了 AZG2 与腺嘌呤和 tZ 的结合，而较高的 pH 则降低了结合亲和力。
2. AZG2 的 apo 状态结构：研究人员利用冷冻电镜技术，解析了 AZG2 在 apo 状态下的结构。AZG2 形成同源二聚体，每个亚基包含 14 个跨膜片段，可分为运输结构域和支架结构域。与 AZG1 相比，AZG2 的细胞外结构域相对较小，且参与二聚体形成的 TM5 - TM6 连接子比 AZG1 短，导致其在细胞外区域的二聚体界面与 AZG1 不同。通过测定不同 pH 条件下的结构发现，pH 5.5 时，AZG2 的一个亚基发生构象变化，从 pH 7.4 时的向内朝向构象转变为封闭构象，表明 AZG2 可能采用电梯式运输机制。
3. AZG2 对腺嘌呤和 tZ 的配位作用：研究人员分别测定了 AZG2 在 pH 5.5 时与腺嘌呤和 tZ 结合的结构。在腺嘌呤结合结构中，腺嘌呤位于 TM3 和 TM10 交叉形成的口袋中，通过 π - π 相互作用和氢键与周围氨基酸残基结合。在 tZ 结合结构中，tZ 的嘌呤环与腺嘌呤结合方式相似，其异戊二烯侧链的羟基还与 D345 和 T392 形成氢键 。通过对突变体的研究发现，Y56、M138 和 F396 等残基参与的氢键和 π - π 相互作用对底物识别和运输至关重要。
4. AZG2 在 tZ 运输过程中的结构动态变化：在 pH 7.4 条件下，研究人员发现 tZ 结合的 AZG2 存在两种不同的构象，分别命名为 state - 1 和 state - 2 。state - 2 为封闭构象，state - 1 为向内朝向构象。从 state - 2 到 state - 1 的转变过程中，运输结构域围绕 TM2 的 N 端枢轴点发生旋转，TM1、TM3、TM4、TM8 - TM10 向胞质侧垂直平移约两个螺旋圈，底物结合口袋向下移动，将负载的 tZ 分子带向细胞质 。分子动力学模拟表明，tZ 在结合口袋中保持结合状态且具有构象灵活性，进一步证实了 AZG2 采用电梯式运输模型。

在讨论部分，研究人员指出，AZG2 在酸性 pH 下的底物结合亲和力和运输活性均高于中性 pH，表明其也能利用质子梯度进行底物运输，但与 AZG1 相比，对质子梯度的依赖程度可能较低。AZG1 和 AZG2 在不同实验系统中运输活性存在差异的原因尚不清楚，AZG2 的亚细胞定位也有待进一步研究 。此外，虽然研究揭示了 AZG2 在不同状态下的结构变化，支持了其采用电梯式运输机制的观点，但为了全面揭示 AZG2 和 NAT 家族转运蛋白的运输循环，还需要捕获更多的构象，特别是向外朝向的构象。

综上所述，该研究通过对 AZG2 的功能和结构进行深入表征，为理解植物细胞分裂素的运输和信号传导机制提供了重要的理论基础，也为进一步比较 AZG1 和 AZG2 在底物运输中的功能差异提供了依据，对深入探究植物激素运输机制具有重要的意义。