探秘 TRIM 蛋白家族：发现 RING E3 假连接酶及其潜在功能意义

在 TRIM 蛋白家族研究中，TRIM 蛋白功能机制不明，其 E3 连接酶活性存在争议。研究人员开展 TRIM 蛋白家族泛素 E3 连接酶活性及 RING 结构特征研究。结果发现部分 “假连接酶”，其 RING 结构改变影响功能。该研究为探索 TRIM 功能及疾病机制提供方向。

　　在生命的微观世界里，蛋白质如同精密的齿轮，推动着细胞的各种活动。TRIM（TRIpartite Motif）蛋白家族便是其中一群重要的 “齿轮”，它们在细胞的感染、分化、DNA 损伤修复以及肿瘤发生等众多关键过程中都发挥着作用。然而，尽管 TRIM 蛋白家族与多种疾病密切相关，但大部分成员的作用机制和调控特征却如同迷雾，让科研人员难以看清。

以往的研究认为，TRIM 蛋白的功能很大程度上依赖于其 RING 结构域赋予的泛素 E3 连接酶活性。泛素 E3 连接酶就像是细胞内的 “标记员”，能给特定的蛋白质加上泛素 “标签”，这些被标记的蛋白质会被细胞识别并进行后续的处理，比如降解，从而调控细胞的各种生理过程。可是近年来，一些研究却发现，部分含有 RING 结构域的 TRIM 蛋白，单独存在时却检测不到泛素化活性，这让 TRIM 蛋白家族的研究陷入了困惑。

为了揭开这些谜团，来自英国弗朗西斯?克里克研究所（The Francis Crick Institute）的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了一项全面的研究，对 TRIM 蛋白家族的泛素 E3 连接酶活性和 RING 结构域的特征进行了深入探究。最终，研究取得了重要成果，发现了 TRIM 蛋白家族中的 “假连接酶”，这些假连接酶的 RING 结构域在同型二聚化或 E2~ 泛素结合界面处发生了结构变化，导致其催化泛素转移的能力受损。这一发现为深入理解 TRIM 蛋白在生理和疾病中的未知功能打开了新的大门，相关研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。通过细胞定位实验，他们将带有 eGFP 标签的 TRIM 蛋白在哺乳动物细胞中表达，借助显微镜观察其在细胞内的分布位置；采用细胞内和体外泛素化分析，分别在细胞内共表达相关蛋白并进行免疫沉淀、在体外构建反应体系，以此检测 TRIM 蛋白的泛素 E3 连接酶活性；利用结构预测技术，借助 AlphaFold2、AlphaFold3 等工具预测 TRIM RING 结构域的模型，从结构层面分析其功能；运用蛋白质相互作用研究方法，如共免疫沉淀、共定位实验，探究 TRIM 蛋白之间的相互作用关系。

研究结果具体如下：

• TRIM 在哺乳动物细胞中的定位差异：研究人员构建了包含 68 个带有 eGFP 标签的 RING 结构域的 TRIM 蛋白文库，并在 U2OS 细胞中表达。通过显微镜观察发现，TRIM 蛋白的定位在不同类别之间和同一类别内部都存在差异。超过一半的 TRIM 蛋白呈现弥漫性细胞质定位，39% 形成小或大的斑点，5% 定位于丝状细胞骨架样结构，还有 32% 在一定程度上定位于细胞核。而且，TRIM 蛋白的定位与 C 末端结构域分类的相关性较差，仅含 PHD - BROMO 结构域的 TRIM 蛋白（VI 类）都定位于细胞核。
• 部分 TRIM 蛋白缺乏泛素连接酶活性：在评估 TRIM 蛋白家族的泛素 E3 连接酶活性时，研究人员采用了细胞内和体外自动泛素化分析。细胞内实验中，68 个含 RING 结构域的 TRIM 蛋白里，有 27 个未显示出高于背景水平的泛素化；体外实验中，15 个 TRIM 蛋白未检测到自动泛素化。部分在体外实验中未显示活性的 TRIM 蛋白，在更换 E2 酶后表现出活性，这表明不同的 E2 酶对 TRIM 蛋白的活性检测有影响。
• 泛素化缺陷 TRIM 蛋白的结构差异：为了深入了解 TRIM 蛋白的结构与功能关系，研究人员对 TRIM RING 结构域进行了计算机模拟分析。结果发现，部分 IV 类 TRIM 蛋白的 RING 结构域存在关键结构差异。例如，TRIM6 预测缺少核心 RING 结构域中的 α2 螺旋，TRIM15 缺少二聚化介导的ɑ1 和ɑ3 螺旋，TRIM51 的核心 RING 结构域中 β3 - β4 区域预测未折叠。这些结构差异可能是导致它们泛素连接酶活性缺失的原因。
• TRIM15 的 RING 结构域特征及活性：TRIM15 的 RING 结构域经预测缺少关键的二聚化螺旋，通过 SEC - MALLS 分析发现其在高浓度下仍保持单体状态，2D 1H15 N HSQC NMR 光谱显示它具有折叠蛋白的特征。进一步的泛素化实验表明，无论使用全长 TRIM15 蛋白还是重组纯化的 RING 结构域，在多种 E2 酶存在的情况下，它都无法催化泛素链的形成，也不能将泛素从 E2~ 泛素 - ATTO 硫酯共轭物上释放到游离赖氨酸上，这说明 TRIM15 的 RING 结构域不具有自结合或泛素化活性。
• TRIM6 和 TRIM22 的结构与活性关系：TRIM6 和 TRIM22 在体外自动泛素化实验中未显示活性。SEC - MALLS 数据表明它们的 RING 结构域能形成二聚体，但 AlphaFold 结构预测显示，TRIM6 的 α2 螺旋可能未折叠，TRIM22 的 α1 和 α3 末端预测可信度低，且二者都存在关键的 “关键残基”（linchpin）突变。通过构建突变体进行实验，发现突变后的 TRIM6 和 TRIM22 能恢复较强的泛素连接酶活性，这表明野生型的 TRIM6 和 TRIM22 由于关键残基缺陷、RING 结构域核心不稳定，无法促进 E2~ 泛素共轭物形成活性的 “闭合” 构象。
• TRIM49 与 TRIM51 的相互作用及功能影响：TRIM49 和 TRIM51 是 IV 类的旁系同源蛋白，TRIM51 在体外无 E3 连接酶活性，而 TRIM49 有。结构预测显示，TRIM51 的 RING 结构域核心 β3 - β4 区域可能折叠不良。实验发现，TRIM49 和 TRIM51 通过卷曲螺旋结构域相互作用并共定位到细胞内的斑点结构中，且 TRIM51 能抑制 TRIM49 的泛素连接酶活性。在自噬方面，TRIM49 过表达促进自噬通量，TRIM51 过表达则抑制 LC3B 脂化，二者对自噬的影响相反。

研究结论和讨论部分表明，该研究揭示了 TRIM 蛋白家族中存在假连接酶这一现象，为进一步探索 TRIM 蛋白的功能提供了新的视角。假连接酶可能具有替代的、潜在的调节作用，比如参与活性和非活性 RING 结构域的配对。然而，对于大多数活性 TRIM 蛋白，其在细胞内底物泛素化是持续进行还是受特定刺激触发，目前仍不清楚。此外，TRIM 蛋白之间的相互调节作用也有待深入研究，形成异源寡聚体的 TRIM 复合物是否是调节 TRIM 泛素 E3 连接酶活性的普遍进化机制，还需要更多的实验来验证。此次研究成果对于理解 TRIM 蛋白在癌症、免疫等多种疾病中的作用机制具有重要意义，为开发新的治疗策略提供了潜在的靶点和方向，有望推动生命科学和医学领域的进一步发展。