高动态灵敏NEMOer钙离子探针：实现可兴奋细胞内质网钙信号成像的革命性突破

编辑推荐：针对现有基因编码钙离子指示剂(GECIs)无法有效检测内质网/肌质网(ER/SR)基础钙释放事件的难题，中国科学家团队开发出新型NEMOer探针系列，其动态范围比G-CEPIA1er提升50倍，首次实现心肌细胞SR中Ca2+闪烁信号(Ca2+ blinks)的活体检测，为研究心血管疾病和神经退行性疾病的ER钙稳态机制提供强大工具。

　　

钙离子(Ca²⁺)作为细胞内的"第二信使"，在从肌肉收缩到神经递质释放等生理过程中扮演着核心角色。其中，内质网/肌质网(ER/SR)作为细胞内最大的钙库，其钙动态的精确调控对细胞功能至关重要。然而，现有的基因编码钙离子指示剂(GECIs)存在动态范围小(<5)、响应速度慢等缺陷，尤其难以捕捉心肌细胞等可兴奋细胞中的基础钙释放事件——就像试图用老式相机拍摄蜂翅，总是错过最精彩的瞬间。

针对这一技术瓶颈，中国科学技术大学等机构的研究人员通过创新性蛋白质工程改造，开发出NEMOer系列探针。这项发表于《Nature Communications》的研究，不仅突破了传统GECIs的性能极限，更首次实现了对心肌细胞肌质网中"钙闪烁"(Ca²⁺ blinks)这一基本释放单元的直接观测，为心血管疾病和神经退行性疾病的研究开辟了新途径。

研究团队主要采用以下关键技术：1)基于NEMO骨架的定向突变策略构建低钙亲和力变体库；2)双荧光Turquoise2-NEMOer)比率型探针开发；3)多模态结构光照明显微镜(Multi-SIM)超分辨率成像；4)原代心肌细胞和神经元电生理-钙成像联用技术；5)斑马鱼转基因模型活体成像。实验样本包括HEK293细胞系、原代大鼠海马神经元、成年大鼠心肌细胞以及斑马鱼幼虫。

工程化低亲和力NEMOer探针
通过系统引入已知的钙亲和力降低突变，研究人员筛选出五种性能优异的变体：通用型NEMOer-m、高对比度NEMOer-c、快速响应NEMOer-f、高亮度NEMOer-b和高灵敏度NEMOer-s。其中NEMOer-f的解离速率常数(k_off=156.75±3.11 s^-1)与G-CEPIA1er相当，但动态范围提升14-29倍。特别值得注意的是，在无钙状态下，NEMOer-c的荧光团亮度仅为G-CEPIA1er的1/4，而钙饱和状态下亮度反超10倍，这种"逆袭"特性使其具备超大动态范围。

非兴奋细胞中的性能验证
在HEK293细胞中，NEMOer探针对离子霉素诱导的ER钙耗竭响应幅度达95.8%，显著优于G-CEPIA1er(71.9%)。当与红色胞质探针R-GECO1.2联用时，NEMOer-f成功捕捉到所有ER钙振荡事件，而传统探针仅能检测50%。比率型TuNer探针结合超分辨率成像，首次揭示ER管腔中钙浓度(约1.9-2.0 mM)是相邻ER片层的两倍，并捕捉到ATP刺激下ER微域中钙补充的离散特征。

神经元中的应用表现
在原代海马神经元中，25Hz电刺激诱导的树突ER钙信号，NEMOer-c的响应幅度显著高于G-CEPIA1er。通过稀疏去卷积算法处理的图像显示，神经元突触棘中的代谢型谷氨酸受体激活信号，NEMOer系列探针均表现出更强的信号衰减。这些发现提示神经元ER钙动态存在更精细的空间异质性。

心肌细胞中的突破性发现
在成年大鼠心肌细胞中，腺病毒递送的NEMOer-f与化学探针Rhod-2联用，首次实现基因编码探针对Ca²⁺闪烁的检测。该探针对咖啡因诱导的SR钙释放响应幅度达75%，优于Fluo-5N(66.7%)。在1Hz电场刺激下，NEMOer-f记录的SR钙碎片(Ca²⁺ scraps)动态与胞质钙瞬变完美同步，其峰值响应(ΔF/F₀=0.35±0.02)远超R-CEPIA1er。去甲肾上腺素处理可显著增大自发放电幅度，证实其在病理状态研究中的价值。

斑马鱼活体成像验证
在5日龄斑马鱼肌肉细胞中，NEMOer-f成功检测到自发性SR钙释放事件，检出率是G-CEPIA1er的2.2倍(48% vs 22%)，响应幅度提升2.7倍，充分展示其在模式生物中的应用潜力。

这项研究开发的NEMOer探针系列，通过三个维度革新了ER/SR钙成像领域：动态范围提升50倍、时间分辨率达毫秒级、光稳定性增强50倍。特别是NEMOer-f首次实现基因编码探针对Ca²⁺闪烁的检测，这一突破堪比在细胞生物学领域发现"新大陆"。比率型TuNer探针与超分辨率成像的结合，首次揭示ER不同亚区间的钙浓度梯度，为理解ER形态与功能的关联提供直接证据。这些进展不仅为心血管疾病、神经退行性疾病的研究提供新工具，更将推动对细胞内钙信号网络的全新认识。未来，通过进一步优化探针光谱特性，有望实现多细胞器钙信号的同步观测，为细胞信号转导研究开启全新维度。