结构导向二硫键工程：限制抗体构象激发 TNFR 激动活性的创新策略

在癌症免疫治疗中，免疫刺激抗体疗效和毒性问题突出。研究人员开展 “结构导向二硫键工程限制抗体构象以激发 TNFR 激动作用” 的研究。结果表明，该策略可增强抗体激动活性。这为设计更有效的抗体疗法提供了新思路。

　　在癌症免疫治疗的广阔战场上，免疫刺激抗体就像是一把双刃剑。一方面，它有着激活免疫细胞、对抗肿瘤的巨大潜力，通过靶向肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）中的共刺激分子，如 4-1BB、CD40 等，能够引发受体聚集，激活细胞内免疫通路，从而激发强大的抗肿瘤反应。但另一方面，它在临床应用中却遭遇了滑铁卢，像 Utomilumab 和 Urelumab 这两种抗 4-1BB 单克隆抗体（mAb），最终都因为疗效不佳或毒性问题而失败。这就如同在黑暗中摸索前行，虽有光明的目标，却找不到正确的道路。

在这样的困境下，来自英国南安普顿大学（University of Southampton）的研究人员决定深入探索，试图找到突破的方向。他们开展了一项关于 “结构导向二硫键工程限制抗体构象以激发 TNFR 激动作用” 的研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。这项研究意义重大，它为设计更强大的抗体疗法提供了一种理性的策略，就像是在黑暗中点亮了一盏明灯，为癌症免疫治疗带来了新的希望。

研究人员在探索过程中，运用了多种关键技术方法。在抗体的制备和处理上，通过定点突变技术构建不同的抗体变体，利用蛋白 A 亲和层析和尺寸排阻色谱（SEC）对抗体进行纯化，并使用胃蛋白酶消化获得 F (ab)₂片段。在评估抗体的特性和活性时，采用表面等离子共振（SPR）技术检测抗体与受体的结合亲和力；运用 NF-κB/Jurkat/GFP 报告细胞系和原代 B 细胞实验来评估抗体的免疫刺激活性；借助小角 X 射线散射（SAXS）结合分子动力学模拟（MD），深入分析抗体的构象变化。

研究结果主要围绕以下几个方面展开：

• 铰链二硫键修饰对抗体的影响：研究人员构建了抗 h4-1BB mAb SAP1.3 的半胱氨酸 - 丝氨酸（C-S）交换变体，与抗 hCD40 mAb ChiLob7/4 的相关变体进行对比研究。通过 NF-κB/Jurkat/GFP 报告细胞系实验发现，在两种抗体中，C-S 变体的激动活性趋势一致，C232S κC214S 变体活性最强，C232S + C233S 变体活性最弱。SPR 和细胞结合实验表明，这些变体与受体的结合亲和力高且相似。SAXS 分析显示，激动活性强的变体构象更紧凑，如 C232S κC214S 变体的回转半径（R_g）和最大分子内距离（D_max）更小。这一系列实验结果表明，铰链二硫键的修饰会影响抗体的构象和激动活性，且这种影响在不同的免疫刺激抗体中具有一致性。
• 结构导向二硫键设计及抗体特性：以抗 hCD40 mAb ChiLob7/4 的 C232S κC214S 变体为基础，研究人员采用两种结构导向的方法引入额外的二硫键。一种是通过直观观察晶体结构，将 K228 突变为半胱氨酸，得到 cross-over + K228C 变体；另一种是利用软件 Disulfide by Design 2.0，确定 T222 和 κE123 两个位点进行突变，得到 cross-over + T222C κE123C 变体。通过结晶学结构测定证实了二硫键按预期形成。SAXS 和 MD 模拟分析显示，这两个新变体比亲本分子更紧凑，构象更刚性，但与亲本分子在结构上仍有相似之处。
• 二硫键工程改造抗体的激动活性：对新变体进行受体结合和生物学活性评估。SPR 和细胞结合实验表明，新变体仍能与 hCD40 高亲和力结合。在 NF-κB 激活实验中，新变体在低浓度下表现出比亲本分子更高的 NF-κB 激活水平，EC₅₀值更低。在原代 B 细胞实验中，新变体在同型黏附、B 细胞激活标记物上调和 B 细胞增殖等方面都表现出更强的活性。这说明引入额外二硫键的抗体分子具有更强的生物学活性。

研究结论和讨论部分指出，这项研究不仅揭示了铰链二硫键修饰对抗体构象和激动活性的影响，还证明了通过结构导向的二硫键工程可以设计出更紧凑、刚性更强且激动活性更高的抗体分子。这种构象限制可能通过调节受体聚集来影响生物学活性，更刚性的抗体变体能够使受体更接近，促进受体聚集，激活下游信号通路，从而引发细胞激活。此外，该研究的成果不仅适用于抗 hCD40 和抗 h4-1BB 的抗体，还可能推广到其他靶向不同受体的抗体，为多特异性抗体的设计提供了新的思路。它为抗体疗法的发展提供了强大的工具，有望推动更有效的单克隆抗体在临床中的应用，让癌症免疫治疗迈向新的台阶。