编辑推荐：
为解决肠道微生物组研究中实验偏差导致的分类鉴定问题，研究人员开展 “Refining microbiome diversity analysis by concatenating and integrating dual 16S rRNA amplicon reads” 主题研究。结果表明，连接双端读数可提升数据输出，整合 V1-V3 和 V6-V8 区域测序读数能增强功能预测。这为微生物组研究提供了新工具。
在人体肠道中，有一群神秘的 “小居民”—— 肠道微生物。它们虽微小，却对人体健康有着巨大影响，与肥胖、糖尿病、炎症性肠病等多种疾病密切相关。随着二代测序技术（NGS）的发展，16S rRNA 扩增子测序和全基因组测序（WMS）成为研究肠道微生物的重要手段。然而，在探索肠道微生物的过程中，研究人员遇到了不少难题。比如，实验中存在各种偏差，像选择不同的分类标记基因和目标区域、测序平台的差异、数据质量不一致以及参考数据库的不同，都会影响对肠道微生物的分类鉴定，导致研究结果出现偏差。而且，16S rRNA 测序和 WMS 都有各自的优缺点，16S rRNA 测序虽经济高效，但在反映微生物群落全貌和功能方面存在局限；WMS 能深入洞察微生物群落和功能数据，却需要大量计算资源和不断更新参考数据库。为了更准确地了解肠道微生物组，跨越这些研究障碍，来自韩国延世大学（Yonsei University）、梨花女子大学（Ewha Womans University）等机构的研究人员展开了一项深入研究。他们的研究成果发表在《npj Biofilms and Microbiomes》上，为肠道微生物组研究开辟了新方向。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用 NCBI 的微生物群落数据集，包括 SRP115494、SRP131748 和 SRP291583 等；采集韩国健康个体和溃疡性结肠炎（UC）患者的粪便样本；对粪便 DNA 进行提取和 16S rRNA 扩增子测序，针对不同区域选用特定引物和测序平台；运用多种分析流程处理数据，如使用 fastp 修剪序列、DADA2 合并或连接序列、去除嵌合体等；通过与不同数据库比对进行分类学分类；利用 PICRUSt2 和 HUMAnN 3.0 分别对 16S rRNA 测序数据和 WMS 数据进行功能预测。
研究结果如下：
- 连接与合并方法的比较验证：通过对 ZIEL-II 模拟群落数据集分析，发现连接（DJ）方法在各 16S rRNA 区域非嵌合读段比对效果更好，能提升微生物多样性和均匀度，相比合并（ME）方法，在 V1-V3、V3-V4 和 V7-V9 区域优势明显。ME 方法在部分区域会高估某些菌科的丰度，如 V3-V4 和 V4-V5 区域的肠杆菌科，而 DJ 方法能纠正部分偏差。综合考虑，使用 DJ 方法并选择 V1-V3 和 V6-V8 区域，结合 SILVA 数据库，可提高分析准确性、减少偏差。
- 优化肠道微生物组分析准确性：基于模拟群落数据，研究发现 ME 方法常高估相对丰度，连接方法（DJ 和 IO）则更准确。不同数据库和引物集评估显示，ME 方法相关系数（R 值）最低，连接方法在使用 SILVA 和 RDP 数据库时，准确性显著提升。
- 连接与合并在肠道微生物组分析中的比较效果：在 SRP131748 和 SRP115494 数据集分析中，连接方法（DJ 和 IO）在非嵌合读段比对、检测微生物多样性和描绘微生物谱方面表现更优，能检测到 ME 方法遗漏的微生物，如在口腔鼻腔分泌物 - 前驱糖尿病组中的肠球菌菌株和 Phascolarctobacterium。
- 16S rRNA 区域选择对肠道微生物分类的影响：对韩国队列粪便样本分析发现，不同 16S rRNA 区域在检测不同菌门和菌科时表现不同。V1-V3 区域检测放线菌门变异性较小，V6-V8 区域对拟杆菌门更稳定；V1-V3 和 V1-V9 区域识别拟杆菌科更一致，V6-V8 区域对双歧杆菌科更敏感。与 WMS 方法相比，各 16S rRNA 区域在分类分辨率上存在差异，连接方法虽有优势，但仍存在偏差。
- 基于校正系数调整双 16S rRNA 读数提升分析准确性：研究人员开发了基于校正系数的 Adj-16S 测序方法，整合 V1-V3 和 V6-V8 区域读数，能更准确调整相对丰度值。该方法检测到一些 WMS 未识别的菌科，在区分健康个体和 UC 患者微生物差异方面表现良好，其结果与 WMS 数据相关性更高。
- 肠道微生物群功能分析：通过 Adj-16S 方法与传统 16S rRNA 扩增子测序和 WMS 比较分析，发现不同方法识别的功能通路数量和种类存在差异。Adj-16S 方法检测到的功能通路数量虽少，但准确性较高，与 WMS 有部分共同通路，还能检测到一些独特通路，为发现潜在生物标志物和治疗靶点提供了线索。
研究结论和讨论部分指出，本研究通过连接 16S rRNA 关键区域 V1-V3 和 V6-V8，优化了肠道微生物组分析。Adj-16S 方法减少了单区域使用的偏差，提高了分类分辨率和功能预测准确性，帮助识别了健康个体和 UC 患者之间的关键微生物差异及相关代谢通路。这些发现为 UC 的诊断和治疗开发提供了潜在途径。不过，研究也存在一些局限性，如模拟群落数据集规模和多样性有限，方法在其他环境或人体部位的适用性有待探索，且需要多种差异丰度方法验证结果。尽管如此，本研究为肠道微生物组研究提供了更高效、经济的方法，有助于深入理解宿主与微生物的相互作用，对精准医疗和个性化治疗的发展具有重要意义，有望推动相关领域的进一步研究和临床应用。
