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本文通过时间分辨的磷酸化蛋白质组分析，研究芽殖酵母细胞周期中细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）磷酸化的调控机制。发现底物控制在 Cdk 磷酸化定时中起重要作用，挑战了传统的激酶 - 磷酸酶调控模型，为理解细胞信号转导提供新视角。
### 研究背景
细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdks）是真核细胞生长和分裂周期的核心调节因子，它能磷酸化众多细胞底物，确保 DNA 复制、染色体分离和细胞分裂等过程有序进行。其调控异常与癌症等疾病相关。目前有两种模型解释 Cdks 如何实现底物的有序磷酸化：“定性模型” 认为细胞周期阶段特异性的细胞周期蛋白赋予不同底物特异性；“定量模型” 则提出 Cdks 通过克服不同的磷酸化阈值来实现底物的顺序磷酸化。此前研究还发现了 “底物控制” 这一调控原则，但在芽殖酵母细胞周期中底物控制对 Cdk 磷酸化定时的影响尚不明确。
实验设计
- 细胞同步化与样本采集：利用交配信息素 α - 因子将芽殖酵母细胞阻滞在 G1 期，然后释放细胞使其同步进入细胞周期，在细胞到达有丝分裂期时，通过转录抑制后期促进复合物（APC）的共激活因子 Cdc20 来阻止细胞周期进一步进展。在 2.5 小时内每隔 15 分钟采集 10 个样本。
- 实验方法
- FACS 分析：通过荧光激活细胞分选（FACS）分析 DNA 含量，以确认细胞周期的同步性。
- Western blotting：检测已知细胞周期标记物的行为，如内源性 Cdk 抑制剂 Sic1、S 期细胞周期蛋白 Clb5 和有丝分裂细胞周期蛋白 Clb2 等。
- TMT 标记和质谱分析：对样本进行串联质谱标签（TMT）标记和质谱分析，以追踪磷酸化位点的动态变化。
实验结果
- Cdk 磷酸化波：对 15760 个磷酸化位点进行分析，发现 8154 个位点在细胞周期中至少有 1.5 倍的相对增加。通过热图展示部分符合 Cdk 磷酸化位点共有序列的位点，呈现出磷酸化事件的波浪状模式。研究还发现，大多数磷酸化位点的变化与蛋白质丰度变化无关或除蛋白质丰度变化外还有其他因素影响。此外，丝氨酸残基的磷酸化时间略早于苏氨酸残基，但差异不显著。
- Cdk 磷酸化速率与体内磷酸化定时的关系：将体外 Cdk 磷酸化速率与体内磷酸化定时进行对比，发现两者相关性较弱。如 Clb5 - Cdk 和 Clb2 - Cdk 的磷酸化速率与底物在细胞周期中的磷酸化时间无显著相关性，表明简单的定量模型无法充分解释观察到的细胞周期磷酸化现象。
- 定性模型的贡献：研究发现 Clb5 特异性底物在体内平均比其他底物早 15 分钟以上磷酸化，这符合定性模型的预测。但在仅含 Clb2 作为唯一 B 型细胞周期蛋白的菌株中，Clb5 特异性底物不再提前磷酸化，说明细胞周期蛋白的特异性对底物磷酸化定时有影响，但并非决定因素。
- Cdk 拮抗磷酸酶阈值与磷酸化定时：通过抑制 Cdk 活性来研究 Cdk 拮抗磷酸酶的作用，发现磷酸酶的作用难以预测底物的细胞周期磷酸化定时。如晚期细胞周期磷酸化靶点的去磷酸化速率并不比早期位点快，激酶 - 磷酸酶评分与底物的细胞周期磷酸化时间也无显著相关性。
- Cdk 底物的 “重新磷酸化” 定时：在 Cdk 抑制剂洗脱后的重新磷酸化实验中，发现重新磷酸化的顺序与正常细胞周期中的磷酸化顺序不同。如 Ndd1 在 1NM - PP1 洗脱后先于 Ask1 磷酸化，且重新磷酸化动力学与细胞周期磷酸化动力学无显著相关性。这表明细胞周期中的许多生物学过程对底物磷酸化顺序有重要影响，可能存在底物控制机制。
- 底物控制与同时发生的细胞周期磷酸化：在许多情况下，同一底物上的多个 Cdk 磷酸化事件会同时发生。通过计算 “动力学距离” 发现，同一蛋白质内的磷酸化位点对的动力学距离明显小于不同蛋白质间的位点对，且这种现象在细胞周期磷酸化实验中更显著。同时，利用 AlphaFold 预测发现，磷酸化位点对的预测欧几里得距离与测量的动力学距离无显著相关性，说明底物控制可导致整个底物的同时磷酸化，且细胞周期进展中的生物学事件会增强这种同时性。
- 底物控制与磷酸化持续时间：测量 Cdk 磷酸化持续时间发现，大多数位点的磷酸化持续时间与细胞周期时间无相关性，这与底物控制模型相符，表明底物控制在 Cdk 磷酸化事件中起重要作用。
研究结论
时间分辨的磷酸化蛋白质组分析揭示了芽殖酵母细胞周期磷酸化的特征，这些特征不能简单地用传统的激酶 - 磷酸酶调控模型解释，而是存在底物控制的特征。底物所处的不断变化的细胞生物学环境、可及性、构象、相互作用和位置等因素对其磷酸化有重要影响。本研究为细胞信号转导决策的研究提供了更广阔的视角，鼓励在相关研究中更广泛地纳入底物控制的概念。同时，研究也指出，定性、定量和底物控制对 Cdk 磷酸化调控的相对贡献仍有待确定，未来需要进一步研究底物调节自身磷酸化的具体机制。
