Lineage-specific CDK activity dynamics characterize early mammalian development：探索哺乳动物早期发育的关键密码

本文聚焦细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），构建小鼠模型量化其活性。研究发现滋养外胚层（TE）细胞在着床前 CDK 活性下降，与成纤维细胞生长因子 4（FGF4）有关，且该调控机制在哺乳动物中保守，为胚胎发育研究提供新视角。

　　### 研究背景
细胞周期受细胞周期蛋白（cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）复合物严格调控。有丝分裂原可促使 G1 期 D 型细胞周期蛋白上调，激活 CDK4 和 CDK6 。这些复合物会磷酸化并使视网膜母细胞瘤蛋白 RB1 失活，推动 S 期进程。在 G2 期末，B 型细胞周期蛋白转移到细胞核，激活 CDK1，促使细胞进入有丝分裂。此外，INK4（p16^Ink4a/p15^Ink4b/p18^Ink4c/p19^Ink4d）和 CIP/KIP（p27^kip1/p21^cip1/p57^kip2）家族的 CDK 抑制剂也会对细胞周期进行调控。

胚胎发育是调控细胞分裂动态、控制细胞数量和命运的典型过程。受精卵发育成囊胚，囊胚由外层极化上皮（滋养外胚层，TE）和内部细胞团（ICM）组成。在着床前，ICM 会分化为原始内胚层（PrE）和上胚层（EPI）。TE 和 PrE 将发育为胚胎外组织，而 EPI 会发育成胎儿。在 8 细胞（8C）阶段，会基于 CDX2 和 SOX2 的互斥表达做出第一个谱系决定，分别指定 TE 和 ICM。第二个谱系决定发生在胚胎第 3.5 天（E3.5）的 ICM 内，涉及 NANOG 和 GATA6 的表达，分别指定 EPI 和 PrE。着床前发育是一个独立于外源性有丝分裂原的自主过程，这表明胚胎细胞中的细胞周期调控途径与其他细胞不同。目前，人们对着床前胚胎细胞周期调控的了解大多来自对胚胎干细胞（ESCs）的研究，ESCs 是 ICM 的体外对应物。然而，尚不清楚不同谱系的胚胎细胞是否表现出振荡或组成型的 CDK 调控，以及 CDK 活性的变化是否会影响体内的细胞命运决定。

实验方法

1. 构建小鼠模型：研究人员使用了一种已有的 CDK 传感器，该传感器包含人类解旋酶 B（DHB）的一部分，其中有四个 CDK 磷酸化位点，并与 mClover3 融合。他们构建了一个转基因，编码 CDK 传感器和与 mRuby3 融合的组蛋白 2B（H2B），两者由 T2A 自切割肽序列隔开（以下简称 DHB/H2B）。将修饰后的 CDK 传感器整合到小鼠 ESCs 的 Rosa26 位点，获得 ESC^DHB/H2B细胞系。通过成像观察 CDK 传感器在细胞内的定位，以细胞质与细胞核的强度比（C/N）作为 CDK 活性的量化指标。为了确定 CDK1 和 CDK2 对传感器转位动力学的影响，研究人员使用了多种 CDK 抑制剂进行处理，并构建了 CDK1 降解子 ESC^DHB/H2B和 CDK2 敲除的 ESC^DHB/H2B细胞系。最后，将 ESC^DHB/H2B细胞微注射到囊胚中，生成嵌合体，并建立了两个独立的小鼠品系。
2. 胚胎收集与培养：雄性杂合 ROSA26^DHB/H2B小鼠与野生型雌性小鼠交配，收集不同发育阶段的胚胎。对于着床前胚胎，从输卵管中冲洗收集；对于着床后胚胎，则在特定培养基中收集。在一些实验中，对 E3.5 的 ROSA26^DHB/H2B胚胎进行体外培养，用于时间推移显微镜实验，并在部分实验中添加外源性 FGF4。
3. 细胞培养：野生型（R1）ESCs 在明胶包被的培养板或饲养层上培养，培养基为高糖 DMEM，添加多种成分。滋养层干细胞（TSCs）在经辐射的 MEF 层上培养，培养基为 RPMI-1640，添加特定成分。人类 ESCs（hESCs，H9 细胞系）在生长因子减少的 Matrigel 包被的培养板上培养，使用 mTeSR plus 培养基。为了生成表达 CDK 传感器的细胞系，研究人员通过慢病毒感染的方式将相关基因导入细胞。
4. 其他实验方法：研究人员还进行了 RNA 提取和 qPCR、免疫荧光、高通量成像（HTI）、蛋白质免疫印迹（Western blot）等实验，以检测相关基因的表达、蛋白质的定位和含量等。此外，还制作了用于类原肠胚实验的 PDMS 印章，并进行了类原肠胚细胞接种和单细胞活细胞追踪等实验。

实验结果

1. CDK 活性在着床前发育阶段的变化：从桑葚胚到中囊胚阶段，胚胎细胞大多表现出 CDK 传感器的细胞质定位，表明这一时期 CDK 活性较高。然而，在晚期囊胚阶段，CDX2⁺的 TE 细胞中，CDK 报告基因出现核积累现象。通过对 E3.5 囊胚的时间推移成像证实，随着胚胎接近着床，TE 细胞逐渐转变为核定位。对单个 TE 和 ICM 细胞的 CDK 活性进行量化分析发现，ICM 细胞的 CDK 活性有轻微振荡，而 TE 细胞更为异质，部分细胞的 CDK 活性下调。研究人员偶尔还观察到 TE 细胞进行核内复制。此外，GATA6⁺的 PrE 细胞和 NANOG⁺的 EPI 细胞在着床前均表现出 CDK 传感器的细胞质定位，着床后 E6.5 胚胎的 EPI 细胞也是如此，这与其快速增殖的动力学特征相符。
2. FGF4 对 TE 细胞 CDK 活性的调控：TSC^DHB/H2B细胞表现出 CDK 传感器的细胞质定位，且对 CDK 抑制的反应与 ESCs 相似，表明 TE 细胞中 CDK 活性下调依赖非自主机制。研究发现，FGF4 剥夺会导致 TSC 分化为非增殖性的滋养层巨细胞（TGCs），并使 CDK 传感器发生核定位，而白血病抑制因子（LIF）撤出对 ESCs 的 CDK 报告基因定位无影响。对单个 ESCs 和 TSCs 的追踪显示，TSCs 在 FGF4 剥夺后，DHB C/N 比值进一步下降，细胞从 G1 或 G2 期退出，部分细胞还会进行核内复制。而且，对 FGF4 剥夺的反应呈剂量依赖性。在体内实验中，外源性 FGF4 可阻止 TE 细胞中 CDK 传感器的核积累，支持了 FGF4 依赖性信号梯度的存在。研究人员还对着床前后的胚胎进行研究，发现附着后的胚胎中，TGCs 表现出 CDK 传感器的核 / 质穿梭和 5 - 乙炔基 - 2′ - 脱氧尿苷（EdU）掺入，但无有丝分裂迹象，且 CDK2 驱动 TGCs 的基因组复制。此外，附着的胚胎表达 p57^KIP2，可能抑制 CDK1 以实现核内复制，而在 TE 细胞中未检测到 p57^KIP2表达，表明着床是体内 p57^KIP2表达所必需的。
3. 人类 TE 样细胞的 CDK 活性变化：研究人员建立了组成型表达 CDK 传感器的 hESC^DHB/H2B细胞系，发现 hESCs 和 naive hESC^DHB/H2B细胞系均表现出较高的 CDK 活性，且对 CDK1/2 抑制剂和 CDK2 急性抑制有反应。通过二维系统模拟人类原肠胚形成，研究人员发现，在 BMP4 刺激下，分化为 TE 样细胞的外环细胞中，低 CDK 活性的细胞富集。对类原肠胚进行分区分析发现，最外层的 CDX2⁺细胞中，CDK 传感器核定位的细胞数量明显增加，使用另一个 TE 样细胞标记物 TFAP2C 也证实了这一结果。而表达中胚层或外胚层标记物的细胞中，未检测到核内有可检测的传感器。此外，在分化的类原肠胚外环中，还检测到 p57^KIP2的富集。

研究结论

1. CDK 活性的动态变化与调控机制：研究揭示了早期发育过程中存在动态且谱系特异性的 CDK 活性景观。TE 细胞在小鼠囊胚接近着床时逐渐降低 CDK 活性，这种变化似乎是由 FGF4 可用性降低引起的，而非 TE 特异性的自主机制。FGF 配体作为位置线索，在着床前胚胎中时空模式化 CDK 活性。
2. CDK 活性与细胞命运的关系：ESCs 中较高的 CDK 活性与其多能性和自我更新能力相关，而细胞周期延长导致的 CDK 循环活性变化会引发分化。然而，研究结果表明，着床前发育过程中的细胞命运决定并非由 CDK 活性的变化所决定。在 E3.5 囊胚阶段，TE 和 ICM 已分离，但随后 ICM 分化为 EPI 和 PrE 的过程中，CDK 活性无明显变化。
3. 保守的调控机制：研究还揭示了哺乳动物在着床过程中存在保守的调控机制。虽然小鼠和灵长类胚胎在着床时的形态相似，但行为和形态发生转化不同。然而，在类原肠胚中分化的 TE 样细胞在转录上类似于人类着床前 E7 囊胚的 TE 细胞，也与着床前小鼠的 TE 细胞具有可比性。

研究局限性

由于实验使用转基因雄性与野生型雌性获得胚胎，缺乏母本报告基因的贡献，无法检测最早发育阶段的 CDK 活性水平。此外，研究未将 CDK 活性与胚胎中的 ERK 活性水平相关联，也未使用特定标记物区分 TE 细胞亚群，以探究其对壁层和极层 TE 的差异影响。最后，虽然发现人类 TE 样细胞的 CDK 活性下降，但未研究 FGF 或其他形态发生素在促进这一变化中的作用。