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寨卡病毒（CHIKV）严重威胁全球公共卫生。本文通过冷冻电镜解析了 CHIKV nsP3 肽与宿主 G3BP1 的 NTF2L 结构域形成的八聚体 - 异源三聚体结构，阐述了二者互作机制，为开发抗病毒疗法提供潜在靶点。
引言
寨卡病毒（Chikungunya virus，CHIKV）是一种通过蚊子（埃及伊蚊和白纹伊蚊）传播的正链单股 RNA 病毒，全球多地都曾爆发疫情。感染 CHIKV 的患者症状多样，包括发热、关节疼痛等，部分患者还会出现长期关节疼痛，新生儿和老年人感染后甚至可能死亡。目前，CHIKV 感染常因与其他病毒症状重叠而被误诊，且其疫苗接种率低，开发抗 CHIKV 药物迫在眉睫。
CHIKV 属于披膜病毒科旧世界甲病毒属，其基因组约 11.8kb，编码非结构蛋白（nsP1 - nsP4）和结构蛋白。nsP3 在病毒复制和宿主调节中发挥多种作用，它包含 N 端宏结构域（Macro）、中央锌结合结构域（ZBD）和 C 端高变结构域（HVD）。Ras GTP 酶激活蛋白结合蛋白（G3BP）是与 nsP3 的 HVD 区域结合的宿主蛋白之一，人类有三种同源蛋白，其中 G3BP1 在宿主应激颗粒（SGs）的组装和动态变化中起关键作用，还能抑制 RNA 病毒复制、增强先天免疫反应。旧世界甲病毒（如 Semliki Forest virus，SFV 和 CHIKV）的 nsP3 可与 G3BP1 结合，阻止 SG 形成，影响病毒复制和增殖，但 CHIKV nsP3 与 G3BP1 复合物的确切结构信息尚未阐明。
结果
- CHIKV nsP3 的新 α 螺旋对形成高阶寡聚体至关重要：通过对旧世界甲病毒 nsP3 的 HVD 区域进行多序列比对，发现几乎所有 nsP3 蛋白都含有两个典型的 FGxF 基序（motifs 1 和 2）。此前研究报道了 SFV nsP3 - 25 肽与 NTF2L 结构域的晶体结构，其中 α1 对结合 NTF2L 很重要。本研究通过二级结构分析，在 CHIKV nsP3 中发现了另一个 α 螺旋（α2），它存在于部分旧世界甲病毒中，但不存在于 SFV 和 Ross River virus（RRV）中。
研究人员表达并纯化了 CHIKV（CHIKV - 43）、Sindbis virus（SINV - 54）和 SFV（SFV - 38）的 nsP3 肽以及 G3BP1 的 NTF2L 结构域。将各肽与 NTF2L 混合进行尺寸排阻色谱（SEC）实验，结果显示，CHIKV - 43（或 SINV - 54）与 NTF2L 形成稳定峰，而 SFV - 38 与 NTF2L 混合物的峰不规则。制备不含 α2 区域的 CHIKV - 26 肽与 NTF2L 混合，发现二者无法形成高阶寡聚体，且 CHIKV - 26 与 NTF2L 的结合亲和力比 CHIKV - 43 降低约 100 倍。这些结果表明，α2 区域在 CHIKV - 43 与 NTF2L 形成寡聚体复合物中起关键作用。
2. CHIKV - 43 与 G3BP1 的 NTF2L 结构域的冷冻电镜结构：用负染色电子显微镜评估 CHIKV - 43、SINV - 54 和 SFV - 38 与 NTF2L 的复合物，发现前两者呈环形，后者未发现结构化蛋白颗粒。随后用单颗粒冷冻电镜方法解析 CHIKV - 43 与 NTF2L 复合物的结构，分辨率约为 2.7?。最终模型由八个 CHIKV - 43 肽和八个 NTF2L 同二聚体组成，理论分子量与 SEC - MALS 分析结果接近。
该复合物存在三种连续但可区分的构象，以比例最高的构象 I 为例，其整体结构为双层环架构，每个环包含四个 NTF2L 二聚体和四个 CHIKV - 43 肽，呈平行四边形。CHIKV - 43 肽与 NTF2L 以 1:2 的摩尔比相互作用，且 CHIKV - 43 肽有两种不同构象，即紧凑构象和延伸构象，FGDF 基序 1 和 2 以及 α1 和 α2 都参与了与 NTF2L 分子的结合。
3. CHIKV - 43 肽与宿主 NTF2L 结构域相互作用的详细分析：CHIKV - 43 与 NTF2L 结构域的界面由氢键、疏水相互作用和离子相互作用介导。CHIKV - 43 的 N 端区域（包含 motif 1 和 α1）和 C 端区域（包含 motif 2 和 α2）与 NTF2L 的结合模式相似，结合亲和力分别为 3.4±0.7 和 2.2±0.5μM。
以紧凑构象为例，CHIKV - 43 的 Ile473（或 Leu491）侧链插入 NTF2L 的疏水腔，Thr474（或 Thr492）的主链氮和氧原子与 NTF2L 中的 Asn122 和 Phe124 形成氢键，FGDF 基序中的 Phe 残基与 NTF2L 的多个残基形成疏水相互作用，α1 和 α2 中的 Glu 和 Asp 残基与 NTF2L 中的 Arg 残基形成离子键。将 α2 中的 Glu500 和 Asp502 突变为 Ala（CHIKV - 43 mut）后，与 NTF2L 形成的复合物分子量变小，结合亲和力减弱，表明这两个残基对 CHIKV - 43 与 NTF2L 的结合至关重要，再次证明 α2 在形成高阶寡聚体中的关键作用。在延伸构象中，CHIKV - 43 与 NTF2L 的界面与紧凑构象相同，且不同 CHIKV 菌株中参与结合 NTF2L 的 CHIKV - 43 残基绝对保守，说明 nsP3 - NTF2L 的相互作用模式在不同菌株中保守。
4. NTF2L 结构域之间的不同相互作用界面：基于 CHIKV - 43 - NTF2L 复合物结构，相邻 NTF2L 二聚体（在每个环中）存在两种不同界面。在紧凑构象中，链 A 中的 Thr75 和 Arg78 与链 H 中的 Asn101 和 Asn69 形成氢键，Arg13 与 Asp28 形成离子相互作用；在延伸构象中，一个 NTF2L 结构域（链 G）的 N 端残基插入另一个 NTF2L（链 F），形成多个氢键和离子键。同时，上下环的 NTF2L 也相互作用，通过 AN、CP、ER 和 GT 处的 20 个氢键维持双层环结构。
5. NTF2L 结构域与其各种伙伴之间的不同结合模式：目前已报道了 NTF2L 结构域与五种伙伴（SFV nsP3、泛素特异性肽酶 10（USP10）、严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS - CoV - 2）N 蛋白、细胞质激活 / 增殖相关蛋白 1（caprin - 1）和核孔蛋白）的晶体结构。NTF2L 有一个 “T 形” 表面凹槽用于结合 FGxF 基序。
通过对不同 NTF2L 结合肽的结构基础多序列比对发现，FGxF 基序的第一个苯丙氨酸（p1 位点）绝对保守，插入 NTF2L 的疏水腔；p - 2 位点的残基完全疏水，结合到 NTF2L 的另一个疏水口袋；p4 位点的苯丙氨酸不严格保守。含 p4 位点苯丙氨酸的 CHIKV nsP3、SFV nsP3 和 USP10 的结合肽呈 “T 形” 折叠，而 p4 位点为其他残基的 SARS - CoV - 2 N、caprin - 1 和核孔蛋白的结合肽呈 “?形” 支架，说明 p4 位点残基可能决定结合肽与 NTF2L 的结合模式。
6. CHIKV - 43 是调节 SG 形成和干扰素产生的关键因素：此前研究表明甲病毒的 nsP3 通过与 G3BP1 相互作用抑制 SG 形成。本研究通过共免疫沉淀（Co - IP）实验发现，nsP3 和 CHIKV - 43 与内源性 G3BP1 明显相互作用，而 nsP3Δ43（缺失 CHIKV - 43 肽的 nsP3）与 G3BP1 的相互作用很弱，免疫荧光（IF）实验也证实 nsP3Δ43 与 G3BP1 的共定位较弱。
在亚砷酸钠诱导的 SG 形成实验中，CHIKV nsP3 组的 SG 形成明显减少。由于 SG 组装可刺激宿主先天免疫反应，上调 I 型干扰素（如 IFNβ）的产生，研究人员用聚（I:C）刺激转染了对照载体、nsP3 或 nsP3Δ43 质粒的 HEK293T 细胞，发现 nsP3 组的 IFNβ 转录水平显著降低。这些结果表明，CHIKV - 43 肽对 nsP3 与 G3BP1 的结合至关重要，在 nsP3 介导的减少 SG 形成和干扰素产生中起重要作用。
讨论
本研究揭示了 CHIKV nsP3 的 CHIKV - 43 肽与 G3BP1 的 NTF2L 结构域结合形成高阶寡聚体的全新结合支架，α2 是稳定该寡聚体的关键因素。nsP3 - G3BP1 相互作用不仅破坏 SG 形成，还抑制宿主干扰素产生，研究人员据此提出了 CHIKV nsP3 劫持 G3BP1 调节 SG 形成和宿主先天免疫的模型。
研究中观察到 CHIKV - 43 - NTF2L 复合物在溶液中有三种构象，可能是 CHIKV - 43 肽的柔性环导致构象差异，其生物学意义有待进一步研究。不同旧世界甲病毒的 nsP3 与 G3BP1 的结合方式不同，如 SFV 和 RRV 不含 α2，甚至 RRV 中 α1 也缺失，推测这与病毒生命周期有关。CHIKV - 43 的 N 端和 C 端与 NTF2L 的结合亲和力相似，而 SFV nsP3 肽的 motif 1 与 NTF2L 的结合更强，可能与 α1 对 motif 1 构象的稳定作用有关。
近期研究报道 CHIKV nsP3 通过 ZBD 结构域形成螺旋支架（HSs），并组织成高阶管状结构，本研究推测双层结构可能连接 nsP3 HSs，促进高阶管状结构形成，但还需实验验证。此外，nsP3Δ43 仍与 G3BP1 有弱相互作用，且对 SG 形成有轻微影响，提示 nsP3 的其他区域可能也参与调节 SG 形成，不同结构域可能存在协同作用。
G3BP1 驱动的 SG 形成在病毒复制、肿瘤发生、癌症化疗耐药和神经退行性疾病中都有作用，因此靶向 G3BP1 开发抑制剂是重要治疗策略。本研究通过比较 NTF2L 结构域与不同伙伴的结合模式，为开发针对 G3BP1 的肽类抑制剂提供了有用的结构信息。
综上，本研究首次报道了 CHIKV nsP3 肽（CHIKV - 43）与 G3BP1 的 NTF2L 结构域形成的高阶寡聚体的冷冻电镜结构，阐述了相互作用机制，为理解 CHIKV nsP3 与宿主 G3BP1 的相互作用提供了新视角，并提供了潜在的抗病毒靶点。
