Myofibroblast-Targeting Extracellular Vesicles: A Promising Platform for Cardiac Fibrosis Drug Delivery—— 靶向肌成纤维细胞的细胞外囊泡：治疗心脏纤维化的药物递送新希望

当前心脏纤维化的药物治疗存在疗效和特异性局限及明显副作用。研究人员开展了以成纤维细胞活化蛋白（FAP）为靶点，利用工程化细胞外囊泡（EVs）构建 αFAP - EL@CLD 递送系统的研究。结果显示该系统能有效抑制肌成纤维细胞（myoFbs）活化和纤维化，为心脏纤维化治疗带来新希望。

　　在全球范围内，心血管疾病（CVDs）是导致死亡的首要原因，影响着超过 5 亿人，仅 2021 年就有约 1210 万人因此丧生。心脏纤维化作为几乎所有心血管疾病进展过程中的一个共同阶段，是心脏在受到缺血、机械应力和炎症等损伤后发生的适应性重塑过程。然而，过度的病理性纤维化通常被认为是不可逆的，它是多种心血管疾病常见的终末途径。

目前针对心脏纤维化的药物治疗手段，如血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素 II 受体阻滞剂和盐皮质激素受体拮抗剂等，由于缺乏靶向特异性，往往疗效有限，还会带来显著的副作用。因此，开发新的策略来减弱或逆转肌成纤维细胞（myoFbs）的活化，成为有效治疗各种心脏疾病的关键。

苏州大学的研究人员为了解决上述问题，开展了一项旨在开发针对心脏纤维化的高效药物递送系统的研究。研究人员发现成纤维细胞活化蛋白（FAP）特异性地在活化的肌成纤维细胞表面表达，而在静止的心脏成纤维细胞中不表达，这使其成为心脏纤维化治疗的一个极具潜力的靶点。基于此，研究人员构建了与抗 FAP 单链可变片段结合的工程化细胞外囊泡（αFAP - EVs），并进一步将其与载氯膦酸盐（CLD）的脂质体结合，形成 αFAP - EL@CLD 递送系统。研究结果表明，αFAP - EL@CLD 负载胆固醇甲基化和硫代磷酸酯修饰的 miR - 29b（Agomir - 29b）或转化生长因子 β1 受体抑制剂 GW788388 后，能够显著抑制肌成纤维细胞的活化，减轻心脏纤维化。并且，这种载药的 αFAP - EL@CLD 囊泡具有高效的治疗效果，同时全身毒性极小。该研究成果发表在《BIOMATERIALS RESEARCH》上，为心脏纤维化的治疗提供了新的方向和潜在的临床应用方案。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法如下：

1. 动物模型构建：选用 6 - 8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠，通过皮下注射异丙肾上腺素（ISO，10mg/kg 体重 / 天）持续 15 天，诱导建立心脏纤维化小鼠模型。
2. 细胞相关技术：培养 HEK - 293T 细胞、分离新生大鼠心肌细胞（CMs）和新生大鼠心脏成纤维细胞（NRCFs）；采用脂质体转染法将构建的质粒转染至细胞；运用超速离心法从细胞培养上清中分离细胞外囊泡（EVs）。
3. 检测分析技术：运用蛋白质免疫印迹法（WB）检测蛋白表达；通过透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）对 EVs 和 αFAP - EL@CLD 的形态和大小进行表征；利用流式细胞术分析细胞对 EVs 的摄取情况等。

研究结果如下：

1. FAP 表达情况：在 ISO 诱导的心脏纤维化小鼠心肌以及 TGF - β1 刺激的心脏成纤维细胞中，FAP 表达上调。通过定量 PCR（qPCR）、WB、免疫组化、流式细胞术和免疫荧光等实验，从 mRNA 和蛋白质水平证实了这一结果。
2. αFAP - EVs 的表征：设计质粒 pCDH - αFAP 并转染 HEK - 293T 细胞，获得 αFAP - EVs。TEM 和 NanoSight 分析显示其呈球形，直径在 50 - 150nm。WB 和流式细胞术表明 αFAP - EVs 表达 EV 相关蛋白，且含有预期的 32kDa 的 Flag - αFAP 蛋白。
3. αFAP - EVs 的靶向能力：体外实验中，用 DiD 标记 αFAP - EVs 后与心肌细胞和心脏成纤维细胞共孵育，发现心脏成纤维细胞对 αFAP - EVs 的摄取明显高于心肌细胞，且活化的肌成纤维细胞对 αFAP - EVs 的摄取高于对照 EVs。体内实验中，将 DiD 标记的 αFAP - EVs 注射到 ISO 诱导的心脏纤维化小鼠体内，结果显示 αFAP - EVs 能有效靶向心脏纤维化部位，但在肝脏和脾脏有大量积累。
4. αFAP - EL@CLD 的制备与表征：通过膜融合技术制备 αFAP - EL@CLD，TEM 和 NTA 显示其呈圆形囊泡结构，直径约 100 - 200nm。WB 和流式细胞术证实其保留了 EV 的特性，且成功表达膜型抗 FAP scFv。
5. αFAP - EL@CLD 的靶向效果：体外实验表明，αFAP - EL@CLD 能被活化的肌成纤维细胞高效摄取。体内实验显示，与对照相比，αFAP - EL@CLD 在肝脏的积累显著减少，在纤维化心脏组织中的分布明显增加。
6. 载药 αFAP - EL@CLD 的治疗效果：αFAP - EL@CLD 负载 Agomir - 29b 或 GW788388 后，体外实验中能显著抑制心脏成纤维细胞的活化。体内实验中，可改善 ISO 诱导的心脏纤维化小鼠的心脏功能，减轻心肌炎症和纤维化。
7. 载药 αFAP - EL@CLD 的毒性评估：体外细胞实验和体内动物实验表明，载药 αFAP - EL@CLD 对细胞无明显毒性，对小鼠的肝、心、肾等主要器官也无明显毒性作用。

研究结论和讨论部分表明，当前心脏纤维化的药物治疗存在局限性，而细胞外囊泡作为药物递送工具展现出潜力。该研究构建的 αFAP - EL@CLD 递送系统能有效靶向纤维化心肌区域，负载 Agomir - 29b 或 GW788388 后，可显著抑制肌成纤维细胞活化和心脏纤维化进展，且具有良好的生物安全性。这一研究成果为心脏纤维化的治疗提供了一种新的、有前景的策略，有望推动心脏纤维化临床治疗的发展，同时也为其他纤维化疾病的治疗研究提供了参考和借鉴。