幽门螺杆菌种群结构与胃癌高风险区抗生素耐药相关变异研究：精准防治的新突破

《Journal of Clinical Microbiology》：Population structure of Helicobacter pylori and antibiotic resistance-associated variants in a high-risk area of gastric cancer

《幽门螺杆菌种群结构与胃癌高风险区抗生素耐药相关变异研究》一文，通过对中国胃癌高风险区临朐县幽门螺杆菌（H. pylori）菌株的研究，揭示其种群结构特点，发现新耐药变异，优化耐药预测模型，为精准治疗和预防胃癌提供关键依据，值得一读。

　　

研究背景

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）是一种与胃癌发生密切相关的病原体，具有高致病性和基因组可塑性。中国临朐县是胃癌高发区，幽门螺杆菌感染率高，且抗生素耐药问题严重，影响胃癌预防效果。此前研究表明，幽门螺杆菌根除是预防胃癌的有效策略，但当地大规模治疗中 27% 的方案失败，可能与抗生素耐药有关。因此，研究当地幽门螺杆菌菌株的基因组特征、耐药机制，对精准治疗至关重要。

材料和方法

1. 参与者和样本：在临朐县开展研究，从参与国家上消化道癌早诊早治项目的人群中，随机选取两个村庄的 468 名符合条件的志愿者，采集胃窦 / 胃角新鲜活检样本。最终成功分离出 165 株H. pylori菌株，其中 153 株完成抗生素药敏试验和全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）。
2. H. pylori分离和抗生素药敏试验：将胃活检组织匀浆后接种于含H. pylori选择性补充剂的营养培养基，在微需氧环境（85% N?，10% CO?，5% O?）、37℃、95% 湿度条件下培养 48 - 72 小时进行菌株分离。采用 MIC 测试条（MIC Test Strip，MTS）检测H. pylori菌株对阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、利福霉素和四环素的药敏性，依据 EUCAST 临床断点表（v.13.0, 2023）判断耐药情况。
3. DNA 提取和全基因组测序：使用 QIAmp DNA Mini Kits 提取H. pylori菌落基因组 DNA，构建 DNA 文库后在 Illumina Novaseq 6000 平台测序，生成 150bp 双端读长的 FASTQ 格式数据。经质量控制、序列修剪后，用 Readfq 提取 100× 干净读长，通过 SPAdes 在 Shovill 管道中进行从头组装，最后用 Prokka 进行注释。
4. 系统发育分析：从 NCBI 和 Enterobase 获取 1541 株已发表的H. pylori菌株数据，利用基于参考比对到H. pylori 26695的全基因组单倍型数据，通过 ChromoPainter 和 fineSTRUCTURE 进行分析，计算固定指数（Fst）以鉴定临朐菌株特异性变异，并构建邻接系统发育树。
5. 全基因组关联研究（Genome - Wide Association Study，GWAS）：用 Snippy 鉴定临朐菌株的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），unitig - caller 检测独特重叠序列片段（k - mers），以 k - mers 和 SNP 矩阵为输入，通过 Pyseer 拟合固定模型，筛选与耐药表型相关的变异。
6. 补充文献报道的耐药突变：从高质量综述和综合抗生素耐药数据库（CARD）中选取 195 个文献报道的耐药突变，对候选耐药基因测序数据进行多序列比对，用卡方检验、Fisher 精确检验和 Mann - Whitney 检验评估突变与耐药的相关性。
7. 构建抗生素耐药预测模型：整合 GWAS 发现的新 k - mers 和 SNP、hefA突变及文献报道的突变，将 153 株临朐菌株按 7:3 比例分为训练集和测试集，用逻辑回归构建模型，通过受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲线评估模型性能。
8. 逆转录 - 定量聚合酶链反应（Reverse Transcription - Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT - qPCR）和hefA基因表达分析：从 49 株不同药敏谱的临朐菌株中提取总 mRNA，进行逆转录和 RT - qPCR，以 16S rRNA 基因作为内参，检测hefA基因表达水平。用中介模型探究hefA表达在突变与耐药关联中的作用。

研究结果

1. 临朐菌株的耐药表型：165 株临朐H. pylori菌株中，153 株（92.7%）有耐药表型。耐药频率较高的抗生素依次为左氧氟沙星（80.4%）、甲硝唑（79.7%）、克拉霉素（63.4%）、利福霉素（41.2%）、四环素（15.7%）和阿莫西林（3.9%）。多数菌株表现出多重耐药，常见耐药组合为克拉霉素 + 左氧氟沙星 + 甲硝唑、克拉霉素 + 左氧氟沙星 + 甲硝唑 + 利福霉素、左氧氟沙星 + 甲硝唑。
2. 种群结构：系统发育分析显示，临朐菌株属于 hpEastAsia 种群，形成独特的临朐相关簇，与其他地区菌株遗传关系有差异。通过计算Fst值，发现临朐菌株与其他 hpEastAsia 菌株相比，在多个基因上存在高度分化的 SNP，如HP1512、HP0971、HP1167等；与其他中国 hpEastAsia 菌株相比，hefA、alpB、hofC等基因上也有显著 SNP，且hefA在临朐菌株与临朐相关簇其他菌株间也有高度分化位点。
3. GWAS 发现的耐药相关变异：GWAS 鉴定出 86 个与克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、利福霉素和四环素耐药相关的显著变异（81 个 k - mers 和 5 个 SNP），未发现与阿莫西林耐药相关的变异。发现多个新耐药基因，如HP1379（lon）与甲硝唑耐药相关，HP1168与克拉霉素耐药相关，HP0211（hcpA）与左氧氟沙星耐药相关。此外，hefA基因存在 9 个突变，其中 R229K 与甲硝唑 MIC 中位数升高显著相关，A283V 与四环素 MIC 中位数升高显著相关。补充文献报道的突变后，确定了 10 个与抗生素耐药相关的显著突变。
4. 抗生素耐药预测模型：基于文献报道的突变构建的模型（Model 1），在训练集和测试集中对不同抗生素耐药的预测性能各异。优化后的模型（Model 2）加入新hefA突变和 GWAS 变异，显著提高了对克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、四环素和利福霉素耐药的预测性能，AUC 值提升明显。根据治疗指南构建的双药耐药预测模型，在训练集和测试集中也表现出较好的预测能力。
5. hefA与抗生素耐药的潜在关联：hefA在临朐菌株中特异性分化且在耐药预测模型中起关键作用。研究发现 A283V 和 R229K 突变分别与四环素和甲硝唑耐药相关。与敏感菌株相比，单药和双药耐药菌株中hefA表达显著增加，中介分析表明hefA表达在 A283V 突变与四环素耐药关联中起重要介导作用，在 R229K 突变与甲硝唑耐药关联中也可能有潜在介导作用。

讨论

本研究系统分析了临朐县幽门螺杆菌菌株的基因组特征，发现其对抗生素的耐药率较高，且种群结构相对独立。新发现的耐药变异，尤其是hefA突变和 GWAS 鉴定的变异，为耐药预测模型优化提供了关键依据，有助于指导类似高风险地区幽门螺杆菌感染的精准治疗和胃癌预防。

研究也存在局限性。样本量较小，可能影响预测模型评估，需要更大规模独立验证；新发现的变异需进行功能探索，以明确耐药机制，开发非侵入性检测方法；甲硝唑药敏试验的微需氧环境可能影响耐药判定，未来研究需加以考虑。

总体而言，本研究为胃癌高风险、抗生素高耐药地区的幽门螺杆菌防治提供了重要参考，优化后的耐药预测模型为精准防治策略制定提供了初步指导 。