创新方法量化与分离登革热病毒包膜蛋白表位特异性抗体：深入解析免疫保护机制

本文推荐一种新型多重微球免疫检测法（MIA），通过生物素化重组蛋白（EDIII/sE/sE-dimer）偶联磁珠，实现登革病毒（DENV）E蛋白表位特异性抗体（抗EDIII/FL/sE-dimer）的高灵敏度定量与分离。该技术突破传统ELISA局限，为解析抗体依赖性增强（ADE）与中和作用的表位基础提供关键工具，对疫苗研发具有重要指导意义。

　　

ABSTRACT

登革病毒（DENV）包膜（E）蛋白是抗体应答的主要靶标。研究团队开发了基于C端生物素化DENV2重组蛋白（EDIII、可溶性E蛋白[sE]及sE-二聚体）的多重微球免疫检测法（MIA），通过颜色编码磁珠偶联技术实现表位特异性抗体的定量检测。实验采用4G2单抗阻断融合环（FL）表位，以中位荧光强度（MFI）量化抗原-抗体反应，并建立三步层析法从人血浆中分离抗EDIII、抗FL及sE-二聚体特异性抗体富集组分。该方法为解析不同抗体亚群在登革热致病或保护中的作用提供了关键技术支撑。

INTRODUCTION

登革热是最重要的蚊媒病毒病，全球半数人口生活在流行区。DENV包含四个，其E蛋白由三个结构域（EDI/EDII/EDIII）组成，其中FL位于EDII，是驱动膜融合的关键元件。针对不同表位的抗体功能各异：抗EDIII抗体具有血清型特异性，抗FL抗体可能引发ADE，而sE-二聚体特异性抗体则表现广谱中和活性。现有血清学检测技术（如ELISA）无法区分表位特异性抗体，而中和试验操作复杂且通量低。本研究旨在开发高灵敏度MIA技术，填补该领域方法学空白。

MATERIALS AND METHODS

研究采用柬埔寨DENV2分离株（GenBank AHG23166）构建重组蛋白，通过果蝇S2细胞表达系统生产含双链锁定的sE-二聚体。使用Bio-Plex磁珠偶联系统优化抗原固定条件，发现链霉亲和素-生物素"连接臂"可显著提升小分子EDIII（19 kDa）的检测信号。人血浆总IgG经蛋白G纯化后，通过阻断实验（4G2单抗）区分FL与非FL表位结合抗体。抗体分离采用分级层析策略：依次使用EDIII、sE-二聚体和sE偶联树脂进行负向/正向筛选。

RESULTS

1. 优化：连接臂策略使抗EDIII抗体信号提升20倍，检测限达100 MFI（1 μg/mL IgG）。
2. 表位特异性验证：EDE特异性单抗C8对sE-二聚体的结合MFI达8,000，而FL特异性1A5仅结合sE单体。
3. 临床样本检测：25例DENV2二次感染患者中，sE-dimer特异性抗体占比最高（ΔMFI=1,200±340），抗FL抗体与总sE结合信号呈显著负相关（P<0.001）。
4. 抗体分离：三步层析法获得高纯度组分（抗EDIII>90%，抗FL>85%，sE-dimer富集组分含72%目标抗体）。

DISCUSSION

该研究创新性地解决了三个关键问题：

1. 通过结构生物学指导的抗原设计（如L107C/A313C突变稳定二聚体界面）保留天然构象表位；
2. 建立"表位竞争阻断-信号减法"策略精准量化交叉反应抗体；
3. 分级洗脱方案克服了传统免疫沉淀的交叉污染难题。局限性在于当前体系仅针对DENV2，且4G2表位覆盖不全。未来可扩展至多血清型检测，并联合假病毒中和实验解析抗体功能谱。

应用前景

这项技术为登革热疫苗的免疫原性评价提供了新维度，特别有助于区分保护性中和抗体与潜在致病性ADE抗体。分离的抗体亚群可用于冷冻电镜表位作图、动物模型被动免疫等研究，推动精准疫苗设计。