编辑推荐：
本文聚焦果蝇卵巢，研究发现 bourbon（bbn）基因缺失致不育和囊性肿瘤。Bbn 与 Ovarian Tumor（Otu）、c - Myc binding protein（Mycbp）形成复合物，促进 Sxl 蛋白表达，且人源 Otu 和 Mycbp 直系同源物也相互作用，为研究生殖细胞分化机制提供重要依据。
### 研究背景
果蝇卵巢是研究成体干细胞和生殖系分化调控的重要模型。在果蝇卵巢中，生殖细胞的分化从卵巢管顶端的生殖原基开始，经历多个阶段，这一过程依赖特定调控机制的逐步展开以及生殖系性别的维持。
在生殖细胞分化过程中，Bag - of - marbles（bam）基因起着关键作用。帽细胞产生的 BMP 配体与生殖系干细胞（GSCs）表面受体结合，抑制 bam 基因转录；当生殖细胞离开帽细胞微环境后，bam 基因表达启动，促使生殖细胞分化。同时，Bam 蛋白与 Benign gonial cell neoplasm（Bgcn）、Meiotic P26（Mei - P26）和 Sex lethal（Sxl）相互作用，抑制 nanos mRNA 翻译，该过程依赖 Sxl 与 nanos mRNA 3’UTR 特定元件的结合，且此复合物可能还调控其他 mRNA。
Sxl 在体细胞中是性别决定的主调控因子，其转录受 X 染色体与常染色体比例的影响，同时也受母源提供的 Groucho（Gro）蛋白的抑制。在雌性体细胞中，Sxl 转录激活后，通过调控下游靶标的可变剪接和 mRNA 翻译，并借助前馈回路促进自身表达；而在雄性体细胞中，Sxl mRNA 因含提前终止密码子的第三外显子，无法产生功能性 Sxl 蛋白。然而，在雌性生殖系中，Sxl 表达的促进机制尚不清楚，已知有 ovo、Ovarian Tumor（otu）、sans fille（snf）和 fused（fu）等因子在 Sxl 上游发挥作用。
Bourbon（bbn）突变体的生殖细胞分化缺陷
研究人员发现，CG14545 基因在生殖细胞中高表达，编码一种进化上差异较大、含卷曲螺旋基序的 16kD 蛋白。通过 CRISPR - cas9 技术将其大部分开放阅读框替换为 dsRED 盒，构建了该基因的敲除突变体。突变体果蝇中，雌性不育，卵巢呈现无配子卵巢管、极少生殖细胞和生殖细胞肿瘤混合的表型，且这些表型随年龄增长无明显变化。bbn 突变体生殖细胞无法表达 Rbfox1（4 - 和 8 - 细胞囊肿的标记物），也不能进入减数分裂，这表明生殖细胞虽启动分化，但无法完成分化过程。将 bbn cDNA 转基因在生殖系特异性 nos - Gal4 驱动下表达，可挽救 bbn 敲除突变体的分化缺陷，恢复其生育能力。
Bbn 的定位及相互作用蛋白
为深入探究 Bbn 的功能，研究人员对其进行了标签标记实验。在 Bbn 的 C 末端标记 HA 会导致果蝇完全不育，卵巢出现无配子和肿瘤样表型，与敲除突变体相似；而 HA::Bbn 定位于 GSCs、成囊细胞和 2 - 细胞囊肿的细胞质中，与 Sxl 的表达模式部分重叠，且后期定位于卵母细胞，与卵母细胞特化相关的细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白 Orb 的定位模式相似。虽然早期生殖细胞分化看似正常，但 HA::bbn 纯合子和与敲除突变体杂交的杂合子在晚期卵子发生过程中表现出缺陷，如保姆细胞无法将细胞质内容物运输到卵母细胞的 dumpless 表型。不过，内源性标记的等位基因在早期生殖细胞分化中仍保留部分功能，可用于后续实验。
通过免疫沉淀和质谱分析，研究人员发现 Bbn 与多种蛋白相互作用，其中排名靠前的是 Otu 和 CG17202（后称 Mycbp）。Otu 是一类去泛素化酶，对生殖细胞分化至关重要；Mycbp 与人类 MYCBP 具有序列同源性。在 S2 细胞中进行的共免疫沉淀实验证实了 Bbn 与 Otu、Mycbp 的相互作用，且结构 - 功能分析表明 Bbn 与 Otu 在 Otu 的去泛素化酶结构域和 Tudor 结构域之间相互作用。此外，研究人员构建了 Mycbp 的敲除突变体，发现其与 bbn、otu 突变体类似，雌性不育，卵巢出现未分化的囊肿，无法进入减数分裂，且可通过 V5::Mycbp 转基因挽救早期发育表型，但晚期卵子发生存在 dumpless 表型。
Bbn、Mycbp 与 Otu 形成复合物
共免疫沉淀实验表明，Bbn 能促进 Otu 和 Mycbp 的相互作用。在 S2 细胞中，若没有 Bbn，Otu 和 Mycbp 不发生相互作用。一系列连续免疫沉淀实验显示，无论实验顺序如何，Bbn、Mycbp 和 Otu 总是共同免疫沉淀，这表明它们形成了稳定的复合物。AlphaFold 建模也支持这一结论，预测 Bbn 和 Mycbp 与 Otu 在 Otu 的去泛素化酶结构域和 Tudor 结构域之间相互作用，且 Bbn 的 N 末端对其与 Otu 的相互作用至关重要。此外，遗传实验表明 Bbn 和 Otu 相互促进对方的稳定性，尽管 Bbn 转基因无法挽救 otu 突变体的表型，otu 转基因也无法挽救 bbn 突变体的表型，但它们之间的物理相互作用、相互稳定作用以及相似的突变表型，都表明这三种蛋白可能共同促进果蝇生殖细胞的分化。
Otu 和 Mycbp 在人类细胞中的相互作用
蛋白质组范围的相互作用研究显示，果蝇 Otu 的人类同源物 OTUD4 和 MYCBP 在人类细胞中存在物理相互作用。在 HCT116 和 HEK293T 细胞中进行的免疫沉淀实验证实了这一点，免疫沉淀 OTUD4 可拉下内源性 MYCBP，免疫沉淀 MYCBP 也可拉下 HA 标记的 OTUD4，这表明从果蝇到人类，Otu 和 Mycbp 同源物之间的物理相互作用是保守的。
Bbn 的功能及对 Sxl 的调控机制
以往研究表明 Otu 在 Sxl 上游发挥作用。研究发现，bbn 或 Mycbp 缺失会导致生殖细胞中 Sxl 蛋白显著减少，与 otu 突变体类似。bbn 突变体卵巢中同时表达雄性和雌性 Sxl 剪接变体，与 otu 和剪接因子 snf 功能缺失突变体的表型相似。然而，Bbn 和 Otu 主要定位于细胞质，这表明它们可能并不直接调节 Sxl 剪接。通过对 bbn 和 snf 进行上位性分析，发现 snf148突变体和 bbn 突变体的双突变体卵巢中，无配子卵巢管的比例显著增加，这表明这两个基因可能通过平行途径调节 Sxl 表达及其他基因。同时，表达 Sxl cDNA（otu>Sxl.cF1）可挽救 snf 突变体卵巢的分化缺陷，减少雄性特异性转录本，但无法挽救 bbn 突变体生殖细胞的分化缺陷，这表明 Bbn、Mycbp 和 Otu 可能通过不依赖剪接的方式调节 Sxl 表达。
Otu 对 Sxl 蛋白稳定性的调控
Otu 属于去泛素化酶家族，但果蝇 Otu 是否具有去泛素化酶活性存在争议。研究人员考虑 Bbn/Mycbp/Otu 复合物可能通过去除或阻止 Sxl 蛋白的泛素化来稳定其水平。用蛋白酶体抑制剂 MG132 和硼替佐米处理培养的卵巢，可使 Sxl 蛋白水平增加，且内源性 Sxl 可与泛素结合柱结合，但无法确定 Sxl 本身是否被泛素化。研究人员构建了携带野生型 Otu 或 S40A 突变（该突变可消除 Otu 体外去泛素化酶活性）的 UAS 转基因，用 nanos - Gal4 驱动转基因在生殖细胞中表达。结果发现，野生型转基因和 S40A 突变体转基因都能挽救 otu1突变体的发育表型，这表明 Otu 的潜在酶活性在成体卵巢生殖细胞分化的早期步骤中并非必需。进一步的免疫沉淀和质谱分析表明，野生型和催化失活的 Otu 都与内源性 Bbn、Mycbp 以及两种生殖细胞特异性 Sxl 异构体 Sxl - PX 和 Sxl - PY 相互作用，这表明 Otu 可能通过不依赖去泛素化的方式调节特定 Sxl 蛋白异构体的稳定性。
讨论
本研究鉴定并表征了由 Otu、Bbn 和 Mycbp 组成的复合物。otu 和 bbn mRNA 在生殖细胞中特异性表达，而 Mycbp 在不同组织中表达更广泛。这三种因子中任何一种缺失都会导致雌性不育，出现无配子卵巢管和早期生殖细胞发育停滞的囊性肿瘤。该复合物在成体卵巢中的一个调控靶点是性别决定因子 Sxl，复合物成员缺失会导致 Sxl 蛋白而非 mRNA 表达丧失。
AlphaFold 建模预测 Bbn 和 Mycbp 与 Otu 在远离其催化结构域的区域相互作用，生化实验支持了这一模型。Bbn 促进 Otu 的稳定性，并是 Otu 与 Mycbp 相互作用所必需的。bbn、Mycbp 和 otu 突变体的相似表型进一步表明它们形成复合物促进成体生殖原基中 Sxl 蛋白的表达，但该复合物可能还有除 Sxl 之外的其他靶点。bbn、Mycbp 和 otu 突变体表现出部分穿透性的无配子表型，且至少对于 bbn 突变体，该表型不会随年龄恶化，这表明在该复合物缺失的情况下，生殖细胞并非持续丢失，暗示其在早期生殖细胞特化、维持或迁移中发挥作用，不过具体情况还需进一步研究。
Bbn 和 Otu 复合物可能在晚期生殖细胞分化的其他步骤中发挥作用。otu 的弱突变体和 HA::bbn 等位基因在晚期卵子发生过程中都表现出 dumpless 表型，且两者的保姆细胞核在 5 - 斑点阶段后不能正确解聚，类似 cup 表型。以往研究表明 cup 和 otu 存在遗传相互作用，Cup 在 Otu 和 Bbn 的蛋白质组分析中均被发现，可能是未来研究的重要调控靶点。
研究数据支持 Otu/Bbn/Mycbp 复合物在 Sxl 转录和剪接下游发挥作用的模型。bbn 突变体卵巢中 Sxl 剪接缺陷可通过表达 Sxl cDNA 转基因挽救，但肿瘤表型无法挽救，且 Bbn 和 Otu 定位于细胞质，表明该复合物可能促进 Sxl 翻译或蛋白质稳定性。虽然有证据表明 Sxl 受蛋白酶体调节且可能被泛素化，但 Otu 的去泛素化酶活性对 Sxl 稳定性并非必需。Otu 与 Sxl - PX 和 Sxl - PY 蛋白的物理相互作用表明，Otu 可能以不涉及去泛素化的方式保护 Sxl 蛋白免受降解，未来研究应进一步明确其具体机制。
Otu 是否作为去泛素化酶存在争议，果蝇 Otu 活性位点的丝氨酸替代了经典的半胱氨酸，突变 D37、S40 和 H143 残基会导致体外去泛素化酶活性丧失。本研究数据表明 S40 残基对早期生殖细胞发育和 Sxl 蛋白表达并非必需，Otu 的其他结构域可能负责促进 Sxl 蛋白稳定性，如 Otu 的 Tudor 结构域对生殖细胞增殖和生殖原基中的囊肿形成至关重要，未来对其功能的研究可能为 Sxl 蛋白及其他复合物靶点的调控提供新见解。
此外，在人类细胞系中检测到 OTUD4 和 MYCBP 之间的相互作用，表明这些蛋白的关联在进化中是保守的。OTUD4 具有不同的底物特异性，可作为其他去泛素化酶的支架，以催化独立的方式促进某些靶标的蛋白质稳定性，这提示可能存在其他维持 Sxl 蛋白稳定性的相互作用伙伴，且 OTUD4 还与 RNA 相互作用，果蝇 Otu 是否具有类似功能有待进一步研究。
