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为解决 Cas12a 诱导的 DNA 双链断裂（DSB）修复及相关基因组编辑问题，研究人员开展了关于 Cas12a 切割后靶点滞留对 DSB 修复影响的研究。结果发现 LbCas12a 在 PPEs 的滞留抑制 c-NHEJ，基于此开发的 CIPDEL 策略可用于高效精准基因编辑，意义重大。
在基因编辑的奇妙世界里，CRISPR-Cas 系统堪称强大的 “基因剪刀”，其中 Cas12a 更是凭借诸多独特优势备受关注。与常用的 SpCas9 相比，Cas12a 个头更小，更便于体内递送，其引导 RNA（gRNA）也更短，还能实现多路复用基因组编辑，脱靶效应也更低。但在实际应用中，Cas12a 却面临着一些挑战。当它诱导 DNA 双链断裂（DSB）后，非同源末端连接（NHEJ）介导的靶向整合效率和准确性不尽人意，而同源定向修复（HDR）虽然精准，却效率低下且在非分裂细胞中无法发挥作用。同时，SpCas9 诱导的 HITI 也存在诸如反向整合、准确性欠佳和脱靶效应等问题。为了突破这些困境，浙江大学医学院附属邵逸夫医院等机构的研究人员展开了深入探索。
研究人员聚焦于 Cas12a 切割后靶点滞留对 DSB 修复的影响这一关键问题。他们发现，CRISPR-LbCas12a 在 DSB 末端存在不对称滞留现象，即 LbCas12a 在 PAM 近端末端（PPE）滞留，而 PAM 远端末端（PDE）则被释放。这种不对称滞留会抑制 PPE 处经典非同源末端连接（c-NHEJ）核心因子的招募，使得 PPE 处的缺失长度比 PDE 处长，进而影响了修复的准确性。基于这一发现，研究人员开发了一种名为 Cas12a 诱导的 PDE 连接（CIPDEL）的策略，用于 NHEJ 介导的高效精准基因校正和插入。该研究成果发表在《Genome Biology》杂志上，为基因编辑领域带来了新的曙光。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们通过转染技术将表达质粒导入细胞，利用 T7 核酸内切酶 I（T7E1） 检测切割效率，借助染色质免疫沉淀（ChIP）分析蛋白与 DNA 的结合情况，运用靶向 PCR 扩增和 Illumina 深度测序分析基因编辑效果，还通过流式细胞术、PCR 和 Sanger 测序等技术对靶向整合进行检测 。
研究结果如下：
- NHEJ 修复 LbCas12a 诱导的 DSB 产生不对称缺失：研究人员分别用 SpCas9 和 LbCas12a 靶向小鼠和人类细胞中的多个基因组位点，经分析发现，SpCas9 诱导的 DSB 在 NHEJ 修复时，PPE 和 PDE 处的缺失基本对称；而 LbCas12a 诱导的 DSB 在修复时，PPE 处缺失明显长于 PDE 处，且 “插入 - only” 产物频率极低。
- LbCas12a 诱导的 DSB 的 NHEJ 中的不对称缺失涉及 c-NHEJ：在不同的小鼠胚胎干细胞系中研究发现，c-NHEJ 核心因子如 DNA-PKcs、Ku80 和 XRCC4 参与了 LbCas12a 诱导的 DSB 的 NHEJ 修复过程中的不对称缺失。ChIP 实验表明，LbCas12a 在 PPE 处的滞留会抑制 c-NHEJ 因子的招募，而 PDE 处则更易招募这些因子。
- Cas12a 诱导的 DSB 的兼容粘性 PDE 之间的连接更准确：使用配对的 LbCas12a-sgRNAs 在基因组中产生两个兼容末端进行 NHEJ 修复，发现 C/W 配对的 LbCas12a 产生的两个 PDE 在 NHEJ 修复时，准确性更高，缺失长度更短。
- Cas12a 诱导的 DSB 的 PDE 比 PPE 更易连接：通过构建染色体易位模型，研究发现与 PPE 相比，LbCas12a 诱导的 DSB 的 PDE 与 SpCas9 诱导的 DSB 的末端连接更高效，更易发生易位。
- LbCas12a 诱导的 DSB 的 PDE 促进供体模板准确连接到靶位点：在 293T 细胞的多个位点进行靶向整合实验，结果显示含有两个 PDE 的供体在靶向整合时，产生的 RFP 细胞频率更高，连接也更准确，且更易发生定向整合。
- 通过与 LbCas12a 诱导的 DSB 的 PDE 连接实现精确的基因片段替换：以 CANX、PCNA 和 H4C16 基因为靶点，利用 CIPDEL 策略进行基因片段替换和 C 末端标记。结果表明，该策略能有效实现基因片段替换，且连接准确性高，在不同细胞系中的效率优于部分其他基因编辑策略，脱靶效应也更低。
研究结论和讨论部分指出，CRISPR-LbCas12a 在 DSB 末端的不对称滞留抑制了 PPE 处的 c-NHEJ，而 PDE 处则因更易接触 c-NHEJ 核心因子，促进了更高效准确的末端连接。CIPDEL 策略正是利用了这一独特机制，为靶向整合提供了更安全、精确的选择。不过，该策略目前仍面临一些挑战，如 Cas12a 切割效率有待提高、PAM 限制了靶点选择范围、存在反向和重复整合现象等 。但总体而言，这项研究为基因编辑领域开辟了新的方向，有望在未来的基因治疗等领域发挥重要作用，推动生命科学和健康医学的进一步发展。
