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当前细菌感染诊断面临难题，现有诊断生物标志物存在局限。为解决该问题，研究人员开展利用多粘菌素 B - 荧光素探针（PmBF）检测血液中细菌外膜囊泡（OMVs）的研究。结果显示 PmBF 可特异性标记 OMVs，且循环 PmBF+ EVs 有望作为细菌感染的生物标志物，这为细菌感染诊断提供新方向。
在医疗领域，细菌感染始终是全球范围内导致人类发病和死亡的重要因素。像大肠杆菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）等革兰氏阴性菌，更是在 2024 年世界卫生组织（WHO）细菌优先病原体名单中占据多数。及时、准确地诊断细菌感染，对于患者的治疗和抗生素的合理使用至关重要。然而，目前的诊断方法存在诸多不足。宿主反应标志物，如 C 反应蛋白（CRP）和降钙素原（PCT），对细菌感染缺乏特异性，在早期或局部感染时可能不会显著升高，而且在非细菌感染情况下也会升高。病原体衍生标志物，虽然特异性较高，但在感染早期或细菌载量较低时敏感性不足，还难以区分感染和定植。因此，寻找更精准的生物标志物迫在眉睫。
外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles，OMVs）是革兰氏阴性菌外膜衍生的纳米级球形双层结构，在细菌的生理、致病和细胞间通讯中发挥着重要作用，在细菌感染部位也能检测到它们的身影。但由于生物样本中宿主来源的细胞外囊泡（EVs）数量众多且与 OMVs 理化性质相似，OMVs 在生物样本中的含量又较低，同时血液中还有大量与 OMVs 粒径相似的杂质成分，这些都使得分析 OMVs 困难重重，其作为生物标志物的潜力也未得到充分探索。
为了解决这些问题，南方医科大学南方医院等多家单位的研究人员展开了深入研究。他们开发了一种利用多粘菌素 B - 荧光素探针（Polymyxin B - fluorescein probe，PmBF）检测和定量复杂生物样本中细菌 OMVs 的方法。相关研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先通过合成 PmBF 探针，利用纳米流式细胞术对 OMVs 进行检测和定量分析；同时采用超速离心法分离不同来源的 EVs，借助纳米颗粒跟踪分析（NTA）、蛋白质免疫印迹（WB）和透射电子显微镜（TEM）对 EVs 进行表征；还构建了多种小鼠感染模型，如肺部感染模型等，用于研究 OMVs 在细菌感染中的作用。样本队列来源包括健康个体、细菌感染患者，以及不同处理的小鼠等。
下面来看看具体的研究结果：
- PmBF 特异性识别并定量检测 OMVs：研究人员合成 PmBF 探针，经实验验证其能特异性地与革兰氏阴性菌大肠杆菌结合，而与革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和哺乳动物细胞 HeLa 无明显结合信号。通过与标记细胞膜的染料共定位实验，证实 PmBF 能特异性靶向大肠杆菌来源的 OMVs。纳米流式细胞术检测显示，该方法可有效排除膜碎片等干扰，对 OMVs 进行定量分析，且能检测到低至 2×105 particles/mL 的 OMVs，确定 5 μM 为 PmBF 的最佳工作浓度。此外，PmBF 对 OMVs 的标记效率高于哺乳动物细胞和革兰氏阳性菌来源的 EVs，且抗脂蛋白等干扰能力强。
- PmBF 标记保留 OMVs 完整性和生物活性：经检测，PmBF 标记不影响 OMVs 的粒径、浓度、形态、稳定性以及蛋白质组成。zeta 电位测量表明标记过程对 OMVs 和细菌的 zeta 电位无显著影响。细胞实验显示，PmBF - OMVs 与天然 OMVs 在促进 BEAS - 2B 细胞增殖、细胞摄取和细胞内分布等方面效果相当，划痕实验也表明 PmBF 标记不影响 OMVs 调节细胞迁移的能力，即保留了 OMVs 的生物活性。
- 循环 OMVs 作为细菌感染的早期标志物：研究人员通过对无菌（GF）小鼠和无特定病原体（SPF）小鼠血清的检测，发现 SPF 小鼠血清中 PmBF+ EVs 水平显著高于 GF 小鼠，用抗生素清除小鼠体内细菌后，PmBF+ EVs 水平明显下降，证明该方法可有效识别血清中的 OMVs，且血清中 OMVs 的存在与体内细菌载量相关。在小鼠肺部感染模型中，感染大肠杆菌或肺炎克雷伯菌后，血清 PmBF+ EVs 水平在感染后 6 小时就显著升高，早于细菌培养阳性结果和传统炎症标志物 CRP、PCT 的升高。用表达 mCherry - OmpA 融合蛋白的大肠杆菌感染小鼠，发现感染后血清中 mCherry+ 囊泡增多，且主要来源于感染细菌。动态监测发现，循环 OMVs 水平随细菌感染进程变化，在有效抗生素治疗后逐渐下降。小鼠感染模型实验还表明，早期诊断并进行抗生素治疗可显著提高小鼠生存率。
- PmBF+ EVs 作为细菌感染生物标志物的临床应用：分析健康个体和细菌感染患者血清样本发现，患者血清中 PmBF+ EVs 水平显著高于健康对照组，且血流感染（BSI）患者高于血培养阴性的细菌感染（BI）患者，提示其与感染严重程度相关。受试者工作特征曲线（ROC）分析显示，PmBF+ EVs 对细菌感染和血流感染的诊断具有较高的曲线下面积（AUC），与 PCT、CRP 联合检测可进一步提高诊断效能。此外，PmBF+ EVs 能有效区分细菌感染与病毒、支原体感染。
综合上述研究，研究人员开发的 PmBF 探针结合纳米流式细胞术，为检测和定量复杂生物样本中的 OMVs 提供了有效方法。研究发现循环 PmBF+ EVs 可作为细菌感染的早期生物标志物，在细菌感染的早期诊断和鉴别诊断中具有重要价值。不过该研究也存在一定局限性，如临床验证样本量较小，主要针对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌感染，且多粘菌素 B 耐药菌可能影响检测效果，纳米流式细胞术成本较高且操作要求专业。未来研究需扩大样本范围，评估对耐药菌株的检测适用性，优化探针设计，开发更便捷的检测技术，进一步探索该方法在监测治疗效果和预测临床结局方面的潜力，从而推动细菌感染诊断和治疗的发展。
