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在 DNA 损伤修复中，RNF168 的调控机制尚不明晰。为探究此，研究人员开展了关于 RNF168 调控机制的研究。结果发现 PIN1-SUMO2/3 基序可抑制 RNF168 染色质积累和泛素信号，促进细胞对电离辐射（IR）的抗性。该研究为理解 DNA 损伤修复提供了新视角。
在细胞的微观世界里，DNA 就像一本记录生命密码的珍贵书籍，而 DNA 双链断裂（DSBs）则像是书页上的破损，会威胁到细胞的正常功能和生命的延续。在哺乳动物细胞应对 DNA 双链断裂的修复过程中，RNF168 作为一种关键的 E3 泛素连接酶，起着至关重要的作用。它能够被招募到受损的染色质区域，并放大泛素信号，就像在破损书页处贴上醒目标签，吸引修复蛋白前来修复。然而，如果 RNF168 的活动不受控制，就好比标签贴得太多太乱，会引发一系列问题，影响 DNA 的修复结果，甚至对细胞造成伤害。
长期以来，科学家们一直在探索限制 RNF168 过度积累和异常信号传导的机制。虽然已经发现了一些间接的调控方式，但仍存在一个关键问题：这些间接机制是否足以抑制 RNF168 的过度信号传导？是否还存在尚未被发现的直接机制来精确调控 RNF168 从受损染色质上的清除？为了解开这些谜团，来自英国伯明翰大学（University of Birmingham）的研究人员展开了深入研究。
研究人员通过一系列实验，发现了一个全新的 RNF168 调控基序 ——SUMO-PIN1 辅助染色质调节因子（SPaCR），并详细阐述了作用于该基序的翻译后修饰级联反应。他们发现，细胞周期蛋白依赖性激酶 1/2（CDK1/2）可使 RNF168 的苏氨酸 208（T208）磷酸化，这一磷酸化修饰就像一把钥匙，开启了后续的调控过程。磷酸化的 T208 会与磷酸化依赖性肽基脯氨酰异构酶 PIN1 结合，而 PIN1 则催化苏氨酸 208 - 脯氨酸 209（T208-P209）区域发生异构化，进而促进 RNF168 在赖氨酸 210（K210）处的 SUMO 化和泛素化修饰。最终，泛素化的 RNF168 会被 p97/VCP 从染色质上清除，确保 RNF168 不会在染色质上过度积累。
这一发现意义重大。它揭示了细胞在 DNA 损伤修复过程中，对 RNF168 进行直接调控的重要机制，有助于我们深入理解 DNA 损伤应答的精细调控过程。此外，由于 PIN1、SUMO 化系统和 p97/VCP 均被视为潜在的癌症治疗靶点，该研究结果为开发新的癌症治疗策略提供了理论依据，有望通过调节这些靶点，改善癌症治疗效果。该研究成果发表在《Nature Communications》上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是基因沉默技术，通过转染小干扰 RNA（siRNA）来降低特定基因的表达水平，从而研究该基因在细胞过程中的功能；二是免疫荧光显微镜技术，用于观察细胞内蛋白质的定位和表达情况，直观地了解蛋白质在细胞内的分布和变化；三是蛋白质纯化和体外结合实验，包括使用谷胱甘肽 S - 转移酶（GST）融合蛋白进行蛋白质的纯化，以及通过体外结合实验检测蛋白质之间的相互作用；四是质谱分析技术，如使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - TOF MS）和液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）等技术，鉴定蛋白质的修饰位点和相互作用蛋白。
下面来看具体的研究结果：
- PIN1 调节 RNF168 染色质保留：研究人员通过对未处理和经电离辐射（IR）处理的细胞进行研究，发现缺乏 PIN1 的细胞中，RNF168 在染色质上的积累显著增加。无论是内源性 RNF168 还是外源性 myc - 标记的 RNF168，在 PIN1 缺失的情况下，其在染色质上的富集程度均明显高于正常细胞。此外，使用 PIN1 抑制剂处理细胞后，也观察到了类似的现象，这表明 PIN1 的活性对于调节染色质结合的 RNF168 水平至关重要。
- 苏氨酸 208 磷酸化促进 PIN1 相互作用：研究表明，PIN1 的 WW 结构域能够与 RNF168 结合，且这种结合在细胞受到辐射后会增强。进一步研究发现，RNF168 上的 T208A 突变会破坏其与 PIN1 的相互作用，而将 T208 磷酸化后，PIN1 与 RNF168 的结合能力显著增强。这说明 T208 的磷酸化是促进 RNF168 与 PIN1 相互作用的关键因素。
- 苏氨酸 208 是 CDK1/2 激酶的靶点：研究人员制备了针对磷酸化 RNF168（pT208 - RNF168）的抗体，并通过实验发现，CDK1/2 激酶抑制剂能够显著降低 T208 的磷酸化水平。同时，敲低 CDK1/2 的表达也会减少 T208 的磷酸化，这表明 RNF168 的 T208 是 CDK1/2 激酶的作用靶点，CDK1/2 负责催化 T208 的磷酸化。
- 操纵 RNF168 的 T208 和 P209 改变其染色质积累：T208A 突变的 RNF168 在受到 IR 处理后，会形成更亮的 IR 诱导焦点，且在染色质上的富集程度更高。而 P209A 突变则能够抵消 T208A 突变带来的影响，使 RNF168 的定位和染色质富集水平恢复到与野生型相似的状态。这表明 T208 和 P209 在调节 RNF168 染色质积累过程中起着重要作用。
- PIN1 活性与 RNF168 SUMO 化相关：研究发现，RNF168 的 SUMO 化修饰主要发生在 K210 位点，且 PIN1 的缺失或 T208 的突变会降低 RNF168 的 SUMO 化水平。而 P209A 突变能够恢复 T208A 突变导致的 SUMO 化抑制。此外，敲低 SUMO2/3 会显著增加 RNF168 在染色质上的富集，表明 SUMO 化修饰对 RNF168 的染色质积累具有抑制作用。
- T208 促进 RNF168 通过 p97/VCP 清除：研究表明，T208A 和 K210R 突变会降低 RNF168 的泛素化水平，且 RNF168 与 SUMO 靶向的 E3 泛素连接酶 RNF4 的相互作用依赖于 T208 的磷酸化。敲低 RNF4 会增加野生型 RNF168 在染色质上的结合，但对 T208A 突变体影响较小。此外，抑制 p97/VCP 的活性会导致 RNF168 在染色质上的积累增加，表明 p97/VCP 参与了 RNF168 从染色质上的清除过程。
- T208 限制染色质泛素化和 53BP1 招募：T208A 突变的 RNF168 会导致染色质上 H2A 和 γH2AX 的泛素化水平增加，进而促进 53BP1 的招募，形成更大、更强烈的 53BP1 焦点。然而，T208A 和 K210R 突变均会损害 BRCA1 的招募，表明过度的 53BP1 积累会抑制 BRCA1 的招募，影响 DNA 修复过程。
- RNF168 - SPaCR 基序对 IR 抗性至关重要：通过克隆形成实验，研究人员发现 RNF168 缺失的细胞对 IR 敏感，而补充野生型 RNF168 或 T208A - P209A 双突变体能够恢复细胞的抗性。但补充 K210R 或 P209A - K210R 突变体的细胞仍对 IR 敏感。此外，部分敲低 53BP1 能够恢复 T208A - RNF168 表达细胞的 BRCA1 焦点形成和 IR 抗性，表明过度的 53BP1 积累是导致细胞对 IR 敏感的主要原因。
综上所述，研究人员发现的 SPaCR 基序在调节 RNF168 染色质积累和 DNA 损伤修复过程中起着核心作用。这一发现为深入理解 DNA 损伤应答机制提供了新的视角，也为开发针对 DNA 损伤相关疾病的治疗策略提供了潜在的靶点和理论基础。未来，进一步研究 SPaCR 基序在不同细胞环境和疾病状态下的功能，以及探索如何精准调控这一基序，将有助于推动生命科学和医学领域的发展。
