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本文聚焦 BRCA1 错义变异分类难题，评估了 AlphaMissense、ΔΔG 等结构相关证据对 ACMG/AMP 中 PP3/BP4 计算证据的影响。研究发现 AlphaMissense 表现更优，且相对溶剂可及性（RSA）对评估很关键，为精准解读 BRCA1 变异提供新依据。
### 研究背景
下一代测序技术应用于临床，使遗传诊断迎来变革，但也带来大量意义不明的遗传变异（VUSs）。对于通过功能缺失与疾病关联的基因，无义 / 移码变异易标注，而错义变异评估复杂。许多错义变异对蛋白质功能影响不一，降低热力学稳定性是错义变异致病的重要因素。
ClinGen 变异整理专家小组（VCEP）依据美国医学遗传学与基因组学学会 / 分子病理学会（ACMG/AMP）框架对变异分类，获美国食品药品监督管理局（FDA）认可，然而罕见错义变异分类仍具挑战。在缺乏临床和功能数据时，ACMG/AMP 致病性 / 良性证据局限于 PM2（支持级别）和 PP3/BP4（基于多序列比对保守性预测），且该框架未明确纳入蛋白质结构信息。目前 ClinGen ENIGMA BRCA1 和 BRCA2 VCEP 使用 BayesDel 评分评估 BRCA1 错义变异，本研究旨在探究基于 ΔΔG 预测和 / 或 AlphaMissense 致病性评分的结构特征纳入对 BRCA1 错义变异 ACMG/AMP 分类的价值。
材料和方法
从一项报告 2086 个 BRCA1 错义变异 RNA 和功能评分的多重变异效应分析（MAVE）实验入手，生成包含 1638 个错义变异（536 个针对 RING 结构域，1102 个针对 BRCT 结构域）的测试队列。使用 FoldX5.0 和 6 种基于网络的方法预测 ΔΔG，以实验性 PDB 文件（ΔΔGPDB）和 AlphaFold2 模型（ΔΔGAF）作为 FoldX5.0 输入模板。用 JOY 的 psa 模块计算相对溶剂可及性（RSA），从相关数据库获取 BayesDel 评分和预计算的 AlphaMissense 评分。利用 R 软件及相关包进行统计分析和绘图，使用在线工具评估似然比（LR）并转化为证据强度，还从乳腺癌诊断基因测序后研究（BRIDGES）获取部分变异数据。
结果
对 1638 个错义变异分析发现，按功能结构域分层，RING 和 BRCT 结构域中功能受损（LoF + INT）变异占比均为 28%；按 RSA 分层差异显著，针对埋藏、部分埋藏和暴露残基的功能受损变异占比分别为 42%、16% 和 7%，在 BRCT 结构域更明显。
FoldX5.0 预测显示，不同功能类别的变异平均 ΔΔG 值不同，且基于 ΔΔG 对 MAVE 功能类别的分层在针对埋藏 / 部分埋藏残基的变异中表现更好。AlphaMissense 和 BayesDel 趋势相似，且它们与 MAVE 功能评分的相关性存在差异，AlphaMissense 相关性最高。
在区分功能缺失（LoF，代表致病性）和功能正常（FUNC，代表良性）变异的性能上，AlphaMissense（auROC = 0.93）优于 ΔΔGAF（auROC = 0.91）、BayesDel（auROC = 0.90）和 ΔΔGPDB（auROC = 0.87）。按功能结构域分层后，AlphaMissense 在 RING 和 BRCT 结构域均表现出色。
分析不同工具提供的 PP3/BP4 计算证据强度发现，AlphaMissense 在特定阈值下能提供相似证据强度且非信息性评分范围的变异比例更低。综合来看，AlphaMissense、ΔΔG（FoldX5.0 预测）和 BayesDel 提供的证据强度在中等到强范围，诊断测试评估未显示工具间有重大差异，但 AlphaMissense 表现更优。
负担型关联分析表明，特定阈值以上的各工具评分能识别出具有临床意义的乳腺癌风险变异，以下则无关联。RSA 影响计算证据，ΔΔG、AlphaMissense 和 BayesDel 对暴露残基变异提供良性证据困难。组合 AlphaMissense 与其他计算评分可增加证据强度分层，对埋藏 / 部分埋藏残基变异效果较好，但对暴露残基变异提供良性证据仍有不足。此外，蛋白全范围 AlphaMissense 分析提示 BRCA1 部分区域可能对蛋白功能重要。
讨论
本研究评估了基于 AlphaMissense 和 ΔΔG 的 PP3/BP4 计算证据对 BRCA1 错义变异 ACMG/AMP 分类的贡献，并与当前 BayesDel - 基于的 PP3/BP4 进行比较。结果显示，AlphaMissense 在减少非信息性评分变异比例上表现更优，且其最佳阈值与开发者推荐不同。
ΔΔG 在特定阈值（约 + 2 kcal/mol）下表现最佳，AlphaFold2 模型在预测 BRCA1 RING 和 BRCT 结构域相关变异时可替代实验性 PDB 文件，但在其他蛋白中情况可能不同。RSA 是评估 ΔΔG - 基于的 PP3/BP4 性能的重要因素，它对 AlphaMissense 和 BayesDel 的性能也有影响。
AlphaMissense 与 ΔΔG、BayesDel 存在相关性，组合使用 AlphaMissense 和 ΔΔG 可增加证据强度分层，并提供更多信息，如帮助识别 INT 错义变异、为 AlphaMissense 提供机制解释等。本研究还提出评估 PP3/BP4 计算证据的一些通用原则，如基于结构分析、关注基因特异性阈值、按 RSA 评估性能、组合使用工具等，但这些原则是否适用于其他蛋白有待进一步研究。
数据和代码可用性
研究生成的数据集可在相关表格中获取。
