视网膜双极细胞类别和类型特化的机制逻辑与时间进程研究：解锁视觉神经发育的关键密码

《Discover Neuroscience》：Mechanistic logic and timing of retinal bipolar cell class and type specification

为探究双极细胞（BC）类型如何特化以及内在和外在因素在此过程中的作用，维多利亚大学的研究人员开展了视网膜双极细胞类别和类型特化机制的研究。结果表明 BC 发育是分步进行的，类别特化先于类型特化，且类型特化依赖于外在因素。这为理解神经元发育提供重要依据。

　　在神秘的神经系统世界里，神经元就像一群分工明确的 “小工匠”，构建着复杂的神经网络。它们被分为不同的类别，每个类别中又包含多种各具特色的细胞类型。然而，科学家们虽然对神经元类别特化的发育机制有了一定了解，但对于不同神经元细胞类型形成的具体过程和机制，仍如同雾里看花，存在着诸多未解之谜。

在哺乳动物的视网膜中，双极细胞（bipolar cell，BC）作为视觉信号传递的关键 “接力手”，负责将光感受器细胞的信号传递给无长突细胞和神经节细胞。小鼠视网膜中已发现至少 15 种不同类型的双极细胞，它们依据基因表达和形态特征各有差异。尽管已知一些转录因子在双极细胞终端分化和存活中发挥作用，但在这些转录因子上游，不同双极细胞类型特化的机制却鲜为人知。而且，双极细胞类型的产生方式也存在多种猜测，是直接由视网膜祖细胞（retinal progenitor cell，RPC）发育而来，还是通过中间状态逐步形成？这些问题如同一个个谜团，吸引着科研人员去探索。

为了揭开这些谜团，加拿大维多利亚大学（University of Victoria）的 Alberto Ruiz de Chavez Ginzo 和 Robert L. Chow 开展了一项深入研究，相关成果发表在《Discover Neuroscience》杂志上。这项研究意义重大，它有助于我们深入理解神经元细胞类型多样性的形成机制，为后续探索神经系统发育异常相关疾病的发病机制和治疗策略提供重要线索。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是 EdU 标记技术，通过给出生后 3 天（P3）的小鼠皮下注射 EdU，标记处于 S 期的视网膜祖细胞；接着进行视网膜解离和细胞培养，将 EdU 标记后的小鼠视网膜解离成单细胞，接种在玻片上培养，并设置不同的细胞密度和培养条件；然后利用免疫标记和 EdU 检测技术，对培养的细胞进行处理，用多种抗体标记不同的双极细胞标志物；最后借助共聚焦成像和细胞定量分析技术，观察和分析细胞的标记情况，统计阳性细胞比例。

下面来看看具体的研究结果：

• 双极细胞类别特化先于类型特异性标记物的表达：研究人员推测不同双极细胞类型的产生是分步进行的，相关基因表达会按时间顺序展开，类别特化基因应先于类型特化基因表达。他们以 P3 小鼠为研究对象，用 EdU 标记视网膜祖细胞，在不同时间点收获视网膜，解离后固定并检测不同双极细胞标记物的表达情况。结果发现，泛双极细胞标记物 Tg.Vsx2^BC:Cre 的表达在视网膜祖细胞最后一次 S 期后约 36 小时出现，而亚类（如 Tg.mGluR6:βgal）和类型特异性标记物（如 VSX1、PKCα）的表达则在 12 - 24 小时后才开始出现。这表明双极细胞类别特化发生在细胞周期退出后约 36 小时，之后才是类型特化和分化，符合多步骤模型。
• 双极细胞亚型特化需要非细胞自主因素：为探究外在 / 非细胞自主机制在双极细胞类别 / 类型特化中的作用，研究人员在 EdU 注射后 1、24 或 48 小时解离视网膜，将细胞分别在高密度（保留细胞间接触）和低密度（减少细胞间接触）条件下培养至 P8（120 小时）。结果显示，虽然在不同时间点和密度下都能观察到 Tg.Vsx2^BC:Cre⁺、EdU⁺的视网膜细胞，但比例有所不同。在低密度培养且解离时间为 24 小时时，Tg.Vsx2^BC:Cre⁺细胞的比例显著降低，这表明在最后一次 S 期后的前 24 小时，外在 / 非细胞自主因素对稳健的泛双极细胞类别特化是必要的。进一步研究发现，在低密度培养且解离时间为 1 或 24 小时时，双极细胞类型特异性标记物（如 Tg.mGluR6:βgal、PKCα 和 VSX1）在 Tg.Vsx2^BC:Cre⁺、EdU⁺细胞中未被检测到，而在 48 小时解离且低密度培养或高密度培养时则能检测到。这说明双极细胞类别特化可以细胞自主发生，但类型特化需要细胞间接触 / 细胞外在因素，缺乏这些因素时，双极细胞会停留在未分化的中间状态。
• 双极细胞类型特化需要视网膜环境：研究人员想知道介导双极细胞类型特化的非细胞自主机制是由视网膜特异性因子介导，还是仅仅是细胞间的非特异性接触。他们将 P3 EdU 注射小鼠的视网膜细胞在 24 小时解离后，与高密度的人胚肾 293T（HEK293T）细胞或非 EdU 注射的 P4 小鼠视网膜细胞共培养。结果发现，与 HEK293T 细胞共培养时，既不能增加 Tg.Vsx2^BC:Cre⁺、EdU⁺细胞的比例，也不能挽救 ON 型标记物 Tg.mGluR6:βgal 的表达；而与非 EdU 注射的 P4 小鼠视网膜细胞共培养时，则能增加 Tg.Vsx2^BC:Cre⁺、EdU⁺细胞的比例，并挽救 Tg.mGluR6:βgal 的表达。这表明单纯的细胞间接触不足以促进双极细胞类别或类型特化，双极细胞类型特化需要视网膜环境。

综合研究结论和讨论部分，该研究表明双极细胞发育是分步且可分离的过程，类别特化先于类型特化。类别特化在最后一次 S 期后约 36 小时发生，涉及细胞内在和外在机制；而类型特化则依赖于最后一次 S 期后前 48 小时的外在机制。这一发现与之前认为的视网膜细胞类别特化存在内在细胞自主机制的观点相符，但也强调了外在因素在双极细胞类别特化中的重要作用。同时，研究还指出 Notch 和 Hedgehog 通路可能是介导双极细胞类别特化的外在机制候选者。此外，研究结果为进一步探究双极细胞在未发生类型特化时的中间状态提供了方向，也为理解其他神经元细胞类型的发育机制提供了重要参考，对神经系统发育相关疾病的研究具有重要的启示作用，为未来探索相关疾病的治疗策略奠定了坚实的理论基础。