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这篇综述聚焦抗生素耐药性（AMR）这一全球健康威胁。文中总结了新型蛋白质 / 酶在 AMR 中的作用机制，涵盖外排泵样蛋白、抗生素失活酶等多个方面，为深入理解 AMR、开发对抗策略提供重要参考，值得相关领域研究者阅读。
抗生素耐药性：全球健康的严峻挑战
抗生素原本用于治疗和预防细菌感染，但由于过度使用和滥用，细菌逐渐发展出对抗抗生素的能力，产生了抗菌耐药性（AMR）和耐药菌（ARB）。这一问题在全球范围内日益严重，已成为疾病和死亡的主要原因之一，引发了严重的全球健康危机。据统计，2019 年抗生素耐药性感染导致 127 万人死亡，2022 年约 500 万人死亡，预计到 2050 年，这一数字将增至每年 1000 万人，远超癌症死亡人数。此外，AMR 还给医疗保健系统带来沉重负担，美国疾病控制与预防中心（CDC）数据显示，每年因耐药菌感染产生的医疗费用高达 200 亿美元，生产力损失达 350 亿美元。因此，了解 AMR 的分子机制对开发新的治疗策略至关重要。
抗生素作用与耐药机制概述
抗生素通常与细菌共享生态位，其主要生态功能是抑制细菌生长。细菌有细胞壁、细胞膜、核酸和核糖体等重要抗生素作用靶点 ，抗生素的作用方式包括抑制肽聚糖合成、干扰细胞膜功能、抑制核酸合成和靶向蛋白质合成。然而，细菌为了生存，通过各种分子机制快速适应和进化以抵抗抗生素，常见的 AMR 机制有外排泵、修饰酶使抗生素失活、膜通透性改变、抗生素靶标修饰和靶标保护等。细菌可通过染色体基因突变或水平基因转移获得外源性 DNA 编码的耐药决定因子，从而产生耐药性。
外排泵样蛋白与抗生素耐药
外排泵在耐药菌中控制抗生素的积累和运输，是研究最多且靶向性最强的 AMR 机制。根据底物选择性、蛋白质结构和能量来源，已鉴定出多个抗生素外排泵家族。近年来，越来越多具有类似外排泵功能的蛋白质被发现，它们在细菌对多种抗生素的固有和获得性耐药中具有重要意义。
- 含 BON 结构域的蛋白质：BON（细菌 OsmY 和结瘤）结构域是细胞膜中含量丰富的蛋白质。研究发现，含 BON 结构域的蛋白质对碳青霉烯类抗生素具有高亲和力，能使细菌对亚胺培南和美罗培南的最低抑菌浓度（MIC）值大幅增加。还有研究从土壤宏基因组文库中鉴定出一种具有外排泵样功能的含 BON 结构域蛋白质，它对头孢他啶的外排活性最高，可使 MIC 值增加 32 倍以上，并且在细菌细胞中参与抗生素和金属离子耐药性的共选择。含 BON 结构域的蛋白质可自组装成三聚体复合物，形成孔状通道运输抗生素，其保守的 WXG 基序对底物运输功能、寡聚孔形成以及蛋白质与细胞膜的相互作用至关重要。基于这些发现，首次提出了 “一进一出” 的 AMR 机制，但该蛋白的序列 - 结构 - 功能关系仍需进一步研究。
- CmeABC 及其变体：CmeABC 多药外排系统由 CmeA、CmeB 和 CmeC 三个蛋白组成，在空肠弯曲菌（C. jejuni）对氯霉素、氟喹诺酮类、四环素和大环内酯类等多种抗生素的耐药中起关键作用。CmeB 包含特定的底物结合位点，负责质子动力势依赖的主动运输，CmeA 是周质膜融合蛋白，CmeC 形成外膜通道，三者协同作用排出抗生素。近期，Yao 等人鉴定出一种强效变体 RE - CmeABC，显著增强了弯曲菌对多种抗生素的耐药性。Zhang 等人测定了 RE - CmeB 与多种抗生素结合的三维结构，确定了关键配体结合残基以及 RE - CmeB 与抗生素之间的重要相互作用，但 RE - CmeB 如何将抗生素转运出细胞以及哪些氨基酸残基起重要作用仍有待研究。
- NiCoT 转运蛋白：金属离子常作为 AMR 在人类病原体中增殖的共选择因子，可增强抗生素运输，导致细菌固有敏感性降低、获得协同耐药机制和对化学无关化合物的交叉耐药。NiCoT 转运蛋白家族是广泛存在于各种生物中的 Ni/Co 转运蛋白。Adhikary 等人发现结核分枝杆菌（Mtb）的 Rv2856（NicT）具有运输镍 / 钴和抗生素的能力，NicT 诱导的细胞内镍摄取增加可使大肠杆菌 CS109 和耻垢分枝杆菌对多种抗生素（如氧氟沙星、庆大霉素等）的耐药性增强，且 NicT 参与了抗生素外排的主动过程。对接研究表明，NicT 结构域 II 中的多个保守残基（如 Asp82、His83 和 Asp88）有助于形成氢键网络，其他一些残基则主要贡献疏水和范德华相互作用。
- AadT 泵：在临床环境中，多药外排泵与不动杆菌属菌株对多种抗生素的耐药性发展有关。编码推定泵的基因大多在物种的核心基因组中被鉴定，也有一些与移动遗传元件（如转座子和质粒）的协同活动有关。例如，最初在大肠杆菌转座子 Tn10 上发现的四环素外排泵 TetB，在许多不动杆菌菌株和其他革兰氏阴性菌中也有报道。近期，在不动杆菌的多个质粒中鉴定出一组编码属于 Drug:H? 反向转运体 2（DHA2）家族的外排泵基因，其中 AadT 是一种新的外排泵蛋白，能显著降低细菌对红霉素、四环素和氯己定等多种抗菌药物的敏感性，其同源物通常与不动杆菌属中 AdeAB (C) 外排泵变体相邻，暗示 AadT 可能与 AdeAB (C) 变体协同作用，但这一关系仍需更多研究数据证实。
- 新型膜转运蛋白 SstFEG：猪链球菌是重要的人畜共患病原体，对养猪业和人类健康构成全球威胁，它也是抗生素耐药基因的储存库。杆菌肽是一种在畜牧业中广泛用作生长促进剂的多肽抗生素，但长期使用会导致微生物菌株耐药基因增加。此前已发现多种杆菌肽耐药机制，如 Bce 系统（由调节蛋白 BceSR 和转运蛋白 BceAB 组成）被鉴定为赋予杆菌肽耐药性的外排泵。近期研究发现，一种潜在的外排泵 SstFEG 位于已知的杆菌肽耐药基因 bceAB 和 bceRS 上游。敲除 sstFEG 基因会使猪链球菌突变株对杆菌肽的敏感性显著降低，且 BceAB 转运蛋白和双组分系统 BceRS 是 SstFEG 介导的杆菌肽耐药所必需的。此外，SstFEG 在猪链球菌的定植和毒力方面也起着重要作用。
- SA09310 蛋白：金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性病原体，可引起多种临床疾病，因其能抵抗多种抗菌化合物而臭名昭著。金黄色葡萄球菌在治疗过程中进化出多种抗生素耐药机制，其中外排泵介导的耐药性研究最为广泛。据计算机分析，金黄色葡萄球菌染色体上有 31 种多药外排泵，几乎涵盖所有泵蛋白家族，但只有三分之一的外排泵此前被表征，其生物学功能仍知之甚少。近期研究鉴定并表征了一种新的多药耐药外排蛋白 SA09310，它由 12 个跨膜螺旋组成。敲除 sa09310 基因的突变株对强力霉素和四环素的敏感性增强，MIC 值分别增加 8 倍和 64 倍，表明 SA09310 具有很强的将四环素从细胞内转运到细胞外的能力。SA09310 同源物在葡萄球菌中高度保守，暗示类似 SA09310 的蛋白质簇具有普遍功能，但 SA09310 引起的 AMR 调节机制仍需更多研究。
抗生素的失活机制
部分细菌通过酶促降解或修饰抗生素分子使其失活，从而获得 AMR，这种现象在病原体中越来越普遍。常见的抗生素失活方式包括水解、化学基团转移，以及近年来发现的氧化和还原失活等。
- 氧化失活：由于新抗生素配方的缺乏以及现有抗生素的过度使用和滥用导致 AMR 出现，氯霉素类抗生素成为研究重点。氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟苯尼考（FF）因抗菌谱广、成本低而常用于治疗感染，但它们在制药、畜牧、家禽和医院废水中的积累和分布，促使了氯霉素耐药菌的产生。此前已报道多种氯霉素耐药机制，如酶促乙酰化和水解。Zhang 等人发现一株 CAP 耐药菌株鞘氨醇单胞菌属 Sphingomonas sp. CL5.1 能将 CAP 和 TAP 的丙二醇 C3 - OH 基团氧化为羧基，这是 CAP 和 TAP 抗菌活性所必需的药效基团，代表了一种新的 CAP 耐药机制。随后，Zhang 等人发现了一种名为 CapO 的新型氧化还原酶，可使 CAP 和 TAP 氧化失活，Ma 等人也从鞘氨醇单胞菌科中鉴定出一种新型氧化酶基因 cmO，其对应的氧化酶 CmO 能催化鞘氨醇杆菌属 Sphingobium sp. 菌株中 CAP 和 TAP 在 C - 1’和 C - 3’位置的氧化。对接研究表明，CAP 通过与 CmO 活性口袋中的关键氨基酸残基（如 G99、Y380、M474 和 N518）形成氢键相互作用而定位在其中。此外，CAP 的氧化要么依赖葡萄糖 - 甲醇 - 胆碱型黄素酶，要么依赖额外的醛脱氢酶以提高效率。除氯霉素外，对用于治疗结核病的利福霉素类抗生素的耐药机制也有研究，如利福霉素单加氧酶（Rox）可分解利福霉素，导致细菌对其产生耐药性。
- 还原失活：抗生素因其结构中含有敏感且具反应性的药效基团而具有生物活性，细菌通过进化出有效机制使抗生素失活以实现自我保护。Crofts 等人在流感嗜血杆菌中鉴定出一种硝基还原酶 NfsB，可通过硝基还原使 CAP 失活，其酶促产物为氨基氯霉素。在大肠杆菌中过表达 nfsB 基因会使其对甲硝唑的敏感性显著增加，且甲硝唑可协同减弱流感嗜血杆菌对氯霉素的耐药性，对 NfsB 体外还原氯霉素有微弱抑制作用。Zhang 等人在真菌埃及青霉 Penicillium egyptiacum 中发现一种独特的自我耐药机制，通过细胞内还原失活和细胞外氧化激活形成抗生素自我耐药和生物合成的氧化还原循环，赋予对大环内酯类抗生素 A26771B 的耐药性。对于四氢异喹啉类抗生素（如沙氟沙星 SFM - S、萘啶霉素 NDM、柠檬霉素 LMM 和埃博霉素 ET - 743），其半缩醛药效基团是抗菌和抗肿瘤的重要基团，细菌通过分泌酶（如 NapU、NapW 和 homW 等）对其进行细胞外氧化激活和细胞内还原失活，以控制细胞周围 NDM 的浓度实现自我耐药，研究还确定了 NapW 催化还原的关键氨基酸残基 Asp165。
- Erm 蛋白介导的抗生素失活：Erm 蛋白通常可分为单甲基转移酶（如 ErmN）和双甲基转移酶（如 ErmC′），它们通过攻击腺嘌呤残基的外环氨基，降低大环内酯 - 林可酰胺 - 链阳菌素 B（MLSB）抗生素的亲和力，从而使细菌产生耐药性。近期研究发现，携带 mphB（大环内酯磷酸转移酶）、erm（红霉素抗性甲基化酶）和推定的 mef（大环内酯外排）基因的嗜盐芽孢杆菌 Bacillus halodurans C - 125 菌株对 MLSB 抗生素具有耐药性，该菌株中的 Erm 蛋白（ErmK）与 ErmD 和 Erm 的氨基酸序列同一性分别为 66.2% 和 61.2%，属于双甲基酶。携带 ErmK 的大肠杆菌细胞对泰乐菌素和红霉素表现出显著耐药性，但目前关于 ErmK 介导抗生素失活的研究较少，可通过分子对接和分子动力学模拟等方法进一步阐明其潜在机制，且 Erm 蛋白有望成为开发抑制剂的靶点。
膜通透性改变与抗生素耐药
细菌细胞膜运输受复杂的活动网络控制，以应对外部压力。革兰氏阴性菌独特的细胞包膜由脂多糖（LPS）组成，是阻止抗生素等化学物质进入的主要屏障。降低对特定抗生素的通透性会导致许多革兰氏阴性菌产生 AMR，例如改变细胞膜脂质的表面电荷、通透性、流动性和稳定性，以及通过外膜蛋白（OMPs）（尤其是孔蛋白）改变通透性，都能使细菌对抗生素的敏感性降低。孔蛋白的数量和类型对抗生素进入细菌细胞的影响很大，为有效运输抗生素，革兰氏阴性菌的孔蛋白需进行 “开闭” 切换，而突变通常会显著影响孔蛋白的表达和功能，进而导致获得性 AMR。此外，细胞壁肽聚糖和磷壁酸的改变也与耐药菌有关。蛋白质赖氨酸乙酰化（Kac）修饰是一种常见的蛋白质翻译后修饰（PTMs），在细菌中参与多种生物学功能调节，包括代谢、群体感应、毒力和趋化性等，且与细菌 AMR 有关。通过 Kac 免疫亲和富集和高分辨率质谱方法，已在多种 AMR 蛋白中鉴定出 Kac 修饰位点。例如，DNA 促旋酶的亚基 B 蛋白 GyrB 含有多个赖氨酸位点的 Kac 修饰，可使细菌对喹诺酮类药物产生耐药性。Zhang 等人通过定量蛋白质组学方法比较了致病性嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 对土霉素敏感（OXYS）和耐药（OXYR）菌株的差异表达，发现外膜蛋白 Aha1 的 Kac 肽水平和全蛋白表达均显著降低，Aha1 上 K57、K187 和 K197 位点的 Kac 修饰对调节 OXY 耐药性有负面影响，可控制 OXY 进入外膜，这首次表明蛋白质 Kac 修饰可直接调节细菌的 AMR。过度使用环丙沙星（CIP）导致伤寒沙门氏菌 Salmonella Typhi 出现多药耐药（MDR），这与外膜蛋白（OMPs）直接相关。Akshay 等人通过检测 OMPs 的差异表达，研究了 CIP 耐药菌株中 gyrA 和 parC 的喹诺酮耐药决定区域（QRDR）的功能，发现 CIP 耐药菌株中 gyrA 基因 83 位密码子的单点突变和 parC 基因 80 位密码子的罕见氨基酸替换，为进一步研究 OMPs 和 QRDR 区域突变在喹诺酮耐药伤寒沙门氏菌中的作用提供了有价值的信息。粘菌素耐药性的出现和传播是全球健康面临的挑战。肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae 染色体基因 mgrB 的突变可增加其对粘菌素的耐药性，MgrB 蛋白跨内膜，通过抑制 PhoQ 激酶来抑制 PhoP 磷酸化，而 PhoP 磷酸化对细菌外膜脂质生物合成至关重要。Yap 等人的综述强调了 mgrB 基因突变对膜通透性的影响，导致肺炎克雷伯菌对粘菌素耐药。此外，Feng 等人发现环境相关浓度（0.1 - 100.0 μg/L）的双酚 S 和 AF 可使可移动质粒 RP4 介导的抗生素耐药基因（ARGs）结合转移频率在细菌属内和属间提高 2 - 5 倍，虽对细菌生长无显著影响，但会轻微改变细胞膜通透性，这种双酚诱导的 ARGs 耦合转移在 AMR 的传播中起着重要作用，对全球健康系统构成严重威胁。
抗生素靶标的修饰
病原体通过突变或翻译后修饰对靶标位点进行修饰，阻止抗生素与靶标结合，这是 AMR 发展的有效手段，通常由编码抗生素靶标的基因自发突变或编码蛋白质 / 酶的基因引起。例如，许多临床耐药菌株通过对细菌细胞包膜中分子靶标的化学修饰，对多粘菌素和糖肽类抗生素产生耐药性，多粘菌素耐药通过脂多糖修饰实现，糖肽类耐药则通过修饰细菌细胞壁中的 D - 丙氨酸 - D - 丙氨酸肽链来达成。此外，mecA 和 mecC 基因编码的替代青霉素结合蛋白，使葡萄球菌属菌株对 β - 内酰胺类抗生素的亲和力显著降低，产生耐药性。氟喹诺酮耐药源于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中影响 DNA 促旋酶喹诺酮耐药决定区域的基因突变。鲍曼不动杆菌 Acinetobacter baumannii 中最常见的变化是 RNA 聚合酶和 DNA 促旋酶基因的突变，分别导致对利福平和喹诺酮类药物的耐药性。细菌 DNA 促旋酶 B 亚基（GyrB）可作为发现和开发新型抗生素的有前景的靶点，它能结合 ATP 并催化 ATP 水解，为 DNA 超螺旋提供能量，当 GyrB 抑制剂新生霉素引入临床使用时，具有相同作用机制的抗生素有望成为对抗细菌感染的有效疗法。甲基化是另一种常见的靶标修饰途径，通过对 rRNA（如 23S rRNA 或 16S rRNA）进行甲基化，细菌可降低或完全阻断抗生素（如青霉素）与靶标的结合，从而产生显著耐药性。甲基化可由特定的酶（如甲基转移酶）催化实现，甲基转移酶在修饰核糖体上的 rRNA 元件方面起着关键作用，使细菌对林可酰胺、氨基糖苷类、大环内酯类、链阳菌素和恶唑烷酮等多种抗生素产生耐药性。Tsai 等人揭示了由 RNA 修饰酶 Cfr 导致的 AMR 机制，rRNA 残基 A2503 的甲基化使细菌对多种靶向核糖体的抗生素产生耐药性。其他甲基化的例子，如红霉素抗性甲基化酶（erm），使细菌对林可酰胺类、大环内酯类和链<
