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这篇综述聚焦患者来源肿瘤类器官（PDTOs）在癌症免疫治疗领域的应用。详细介绍了多种培养技术，如浸没基质胶培养、气液界面（ALI）培养等，探讨了其在免疫治疗中的应用，为精准癌症免疫治疗提供了重要参考。
癌症免疫治疗的现状与挑战
肿瘤的发生和发展是一个极为复杂的生物学过程，肿瘤微环境（TME）在其中起着关键作用。在肿瘤的发展进程中，癌细胞会运用多种手段逃避机体的免疫监视，像是上调负调控通路、出现抗原呈递机制缺陷，以及招募具有免疫抑制作用的细胞群体等，这些行为严重阻碍了免疫细胞发挥正常功能，抑制了机体的抗肿瘤免疫反应。
癌症免疫治疗旨在借助患者自身的免疫系统来消灭肿瘤并预防其复发。与传统治疗方式相比，它具有特异性强、副作用少的优势。然而，目前仍有相当一部分癌症患者对免疫治疗不敏感。这是因为在肿瘤发生发展过程中，TME 与肿瘤细胞相互作用，介导了肿瘤免疫耐受，从而影响了免疫治疗的效果。
在癌症免疫治疗领域，缺乏合适的模型来评估治疗效果是一个重大挑战。常用的人类肿瘤模型，如肿瘤细胞系和患者来源的异种移植（PDX）模型，都存在各自的局限性。肿瘤细胞系在培养过程中，基因组、转录组和蛋白质组会不断发生变化，难以真实再现原始肿瘤的遗传异质性；而 PDX 模型在植入患者肿瘤子集时效率有限，且可能出现特定的肿瘤演变。
类器官培养技术助力免疫治疗研究
患者来源肿瘤类器官（PDTOs）的出现，为研究肿瘤演变和评估治疗反应提供了全新的平台。PDTOs 能够有效预测患者对各种治疗的反应，有助于选择最佳的治疗策略。但由于缺乏免疫成分，其在预测免疫治疗方面存在一定的局限性。为了克服这一限制，科研人员开发了多种类器官培养技术来模拟 TME，主要包括浸没基质胶培养、气液界面（ALI）培养、微流控 3D 培养和 3D 生物打印技术。
浸没基质胶培养：该培养方法是将肿瘤活检组织中解离出的肿瘤细胞，培养在 3D 基质胶的圆顶或平层内，并浸没在组织培养基下。根据组织类型的不同，会在培养基中添加各种通路抑制剂和（或）生长因子，针对特定肿瘤组织学定制培养条件，以支持干细胞的自我更新和分化。通过这种方法培养的 PDTOs，能够重现原始肿瘤的组织学、遗传学和表型特征，还能模拟患者对临床治疗的反应，对疾病建模和药物筛选有很大帮助。不过，传统的浸没基质胶培养主要支持上皮细胞的长期增殖，缺乏天然的免疫和基质成分，需要引入外源细胞类型来重建 TME。例如，研究发现胰腺导管腺癌（PDAC）类器官与癌症相关成纤维细胞（CAFs）共培养时，CAFs 产生的 Wnt 可以促进非 Wnt 产生型 PDAC 亚型的类器官生长；同时，PDAC 类器官分泌的转化生长因子 β（TGFβ）和白细胞介素 - 1（IL - 1）能够触发肌成纤维细胞和炎性 CAF 亚型的产生，这表明在 PDAC 微环境中存在不同的成纤维细胞生态位，也凸显了选择性靶向 CAFs 的重要性。此外，通过将小鼠肿瘤类器官与细胞毒性 T 淋巴细胞（CTLs）和用癌症类器官条件培养基脉冲处理的骨髓来源树突状细胞（DCs）共培养，能够产生肿瘤反应性 T 细胞；利用基于胶原蛋白的细胞外基质生成 PDTOs，并将肿瘤细胞与患者匹配的免疫细胞共培养，为个性化癌症免疫治疗提供了可能。
气液界面培养：在 ALI 培养中，PDTOs 最初被嵌入内盘中的胶原凝胶内，外盘中的培养基通过可渗透的 Transwell 扩散到内盘。胶原层的顶部暴露在气液界面的空气中，为细胞提供充足的氧气。与浸没基质胶培养不同，肿瘤组织碎片在 ALI 培养中能够生成 PDTOs，因为肿瘤细胞是与未重建的内源性基质和免疫成分一起培养的。研究表明，源自多种正常组织（如胃、结肠、胰腺和小肠）的 ALI 培养类器官含有上皮和间充质成分；源自肿瘤活检组织（如非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤和肾细胞癌）的 PDTOs 也可以通过这种技术进行培养。利用 ALI 培养的 PDTOs 能够重现原始肿瘤的遗传特征，保留复杂的细胞组成和 TME 结构，肿瘤实质和基质都得以保存，其中包含多种内源性浸润免疫细胞和成纤维细胞。因此，ALI 培养可能比浸没基质胶培养更适合用于 TME 建模。但 ALI 培养需要专门的设备，且无法反映循环免疫细胞向肿瘤的募集情况。
微流控 3D 培养：微流控 3D 培养技术使用混合胶原凝胶来培养小鼠和患者来源的器官型肿瘤球体（MDOTS/PDOTS）。该技术的特点是球体、单细胞和宏观肿瘤碎片的异质混合物。培养基通过位于中央区域两侧的介质通道供应，为球体提供营养。研究发现，通过微流控 3D 培养建立的 MDOTS/PDOTS 保留了原始肿瘤的复杂性和细胞多样性，包括自体淋巴细胞和髓细胞群体，并且免疫活性小鼠肿瘤模型的 MDOTS 能够保留对免疫检查点阻断（ICB）的反应和抗性。与 2D 培养相比，微流控 3D 培养的 MDOTS 实现了对 PD - 1 阻断反应的保留。此外，通过设计新的基于液滴的微流控 3D 培养平台生成的微器官球体（MOSs），能够重现原始肿瘤中的 CAFs 以及髓系和淋巴系免疫细胞，并可用于与外源免疫细胞共培养。添加肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和外周血单核细胞（PBMCs）能够增强它们向 MOSs 的浸润，提高对肿瘤细胞的杀伤效果。不过，微流控 3D 培养的肿瘤类器官也存在一些局限性，如大小均匀，无法反映循环免疫细胞向肿瘤的募集。
3D 生物打印技术：3D 生物打印技术是一种新兴技术，它能够根据生物体的功能和仿生形态需求，利用生物材料和单元进行制造。该技术可以通过精确的建模构建和多细胞控制打印，重构类器官的复杂结构，改善类器官微环境的重建。例如，通过建立 3D 生物打印的微型大脑模型，发现胶质母细胞瘤细胞可以通过主动招募将巨噬细胞极化为与胶质母细胞瘤相关的巨噬细胞特异性表型，巨噬细胞又能触发胶质母细胞瘤细胞在微型大脑中的进展和侵袭；利用多喷嘴挤出生物打印机构建的体外胶质母细胞瘤模型，可用于控制肿瘤构建体的空间结构，进行药物敏感性测试和 TME 研究；利用 3D 生物打印技术开发的患者特异性膀胱组装体，能够反映 TME 成分，突出了肿瘤细胞与基质细胞之间信号传导在调节肿瘤可塑性方面的重要性。因此，3D 生物打印技术通过制造高分辨率的微观结构，促进了 TME 复杂性的再现，为开发高通量药物筛选平台提供了机会，并且有望进一步发展以满足患者的个性化需求。
复杂类器官的制备
为了更好地模拟体内环境，提高类器官在癌症免疫治疗研究中的应用价值，需要对类器官进行进一步的优化，主要包括补充免疫成分和血管。
补充免疫成分：目前有两种将 PDTOs 与免疫细胞共培养的方法，一种是在 PDTOs 中保留和扩增内源性免疫细胞，另一种是向 PDTOs 中补充外源性免疫细胞。研究人员最初利用人类乳腺上皮组织在类器官培养中激活和扩增内源性免疫细胞，通过建立导管上皮类器官，证实了类器官中存在免疫细胞亚群，并描述了类器官内的上皮内淋巴细胞区室。研究发现，乳腺类器官中的白细胞群体与外周血中的不同，双膦酸盐可以刺激保守的 T 淋巴细胞扩增。此外，在胶原基质中培养长达 9 天的 MDOTS/PDOTS 也能够维持自体淋巴细胞和髓细胞群体；ALI 培养能够保留天然的基质和免疫成分，应用于结直肠癌（CRC）和肺癌类器官时，尽管 CD3+细胞数量显著减少，但内源性 CD45+免疫细胞群体可以存活超过 10 天，并且利用 ALI 方法在同基因免疫活性宿主中培养的 PDTOs，能够在长达一个月的时间内重现肿瘤上皮和基质微环境。在胰腺癌类器官与 TME 中多种细胞类型的共培养中，观察到复杂类器官中出现激活的肌成纤维细胞样 CAFs 和肿瘤依赖性淋巴细胞浸润。不过，多种因素会影响共培养的结果，例如在炎症性肿瘤中，免疫细胞与肿瘤细胞紧密相关，而在一些肿瘤中，免疫细胞仅嵌入周围基质中，这会影响类器官培养早期免疫细胞的组成。此外，如果培养时间超过一定限度，就需要补充外源性免疫成分。
补充血管：在培养过程中，类器官的生长大小有限，当类器官直径超过 500μm 时，仅靠扩散无法满足营养物质、氧气和代谢产物的交换需求，会导致中央缺氧核心的形成，进而引发坏死。为了解决这一问题，需要进行血管化和灌注。研究人员开发了多种方法来实现类器官的血管化，例如利用源自球体肺成纤维细胞的血管生成因子引导与微通道相关的血管生成芽的形成，构建的血管网络能够穿透球体内部且无渗漏；将中胚层祖细胞整合到人类肿瘤和神经类器官中，可形成具有分层组织结构的血管，并建立起由基底膜、内皮细胞 - 细胞连接、腔泡和微泡组成的代表性血管超微结构；在类器官 - 内皮细胞共培养中，通过血管内皮生长因子和微流控芯片内的缺氧梯度可以诱导血管化。
复杂类器官在免疫治疗中的应用
复杂类器官在免疫治疗研究中具有重要的应用价值，能够在体外模拟肿瘤与免疫系统的相互作用，为评估免疫治疗效果、揭示肿瘤免疫耐药机制和开发新的联合治疗方案提供有力支持。
外周血单核细胞：肿瘤类器官可以作为肿瘤反应性 T 细胞的来源，通过富集肿瘤反应性 T 细胞来诱导和评估肿瘤特异性 T 细胞的杀伤效率。研究人员通过将肿瘤类器官与 PBMCs 共培养，成功获得了肿瘤反应性 T 细胞。例如，Cattaneo 等人发现，在 2 周内，33% - 50% 的 NSCLC 和微卫星不稳定的 CRC 标本能够获得肿瘤反应性 CD8+T 细胞群体，这表明在个体水平上建立体外 T 细胞免疫治疗测试模型是可行的。Dijkstra 等人建立了基于肿瘤类器官培养的多功能平台，用于扩增和表征患者来源的肿瘤反应性 T 细胞，发现 50% 的 CRC 类器官能够激活来自同一患者 PBMCs 中的 CD8+T 细胞，NSCLC 类器官也有类似的结果。激活的 CD8+T 细胞能够有效杀死肿瘤类器官，而不影响正常组织类器官的存活；共培养产生的 CD4+T 细胞则既能杀死肿瘤类器官，也能杀死正常组织类器官。此外，Zhou 等人优化了患者来源的胆管癌类器官与 PBMCs 和纯化 T 细胞的共培养模型，研究其对类器官细胞生长的抑制作用和诱导细胞死亡的效果；Meng 等人描述了一个从胰腺癌患者中扩增肿瘤靶向 T 细胞的平台，通过将 PBMCs 与自体肿瘤类器官共培养，发现预处理后的 T 细胞发生了克隆扩增，不仅表达组织驻留记忆 T 细胞标记，还能够杀死自体肿瘤类器官。这些研究表明，肿瘤类器官与 PBMCs 共培养具有产生肿瘤反应性 T 细胞的潜力，为实现个性化免疫治疗提供了可能。
肿瘤浸润淋巴细胞：TILs 可以在体外进行扩增，然后回输到患者体内，以产生更强的抗肿瘤免疫反应。Neal 等人利用 ALI 方法培养原发性和转移性肿瘤组织的肿瘤类器官，这些培养物能够在数周内维持多种内源性免疫细胞类型和非免疫基质成分。使用 ICB（包括抗 PD - 1 和（或）抗 PD - L1）治疗能够触发类器官培养中肿瘤抗原特异性 T 细胞的扩增和激活，从而导致肿瘤细胞的破坏。Sui 等人建立了具有高微卫星不稳定性的 CRC 患者的肿瘤类器官，并将其与 TILs 或 PBMC 来源的 T 细胞共培养，发现治疗过程中存在局部炎症的患者更易出现疾病进展，这可能是由于中性粒细胞相关的免疫抑制介导了炎症对 ICB 的抑制作用。此外，与同一患者扩增的 TILs 共培养的 CRC 类器官还可以作为个性化测试平台，预测对新辅助放化疗的反应。与无反应者的共培养相比，对放化疗完全缓解的患者的共培养物表现出显著增强的细胞毒性杀伤作用，这有助于对患者进行分层，并揭示了 TILs 作为潜在生物标志物的功能。值得注意的是，通过 ICB 进一步验证了体外疗效筛选以挽救 TIL 功能的平台，补充抗 PD - 1 抗体能够部分恢复抗肿瘤杀伤活性。
嵌合抗原受体 - T 细胞：嵌合抗原受体（CAR） - T 细胞疗法由于其显著且持久的临床反应，已成为癌症治疗的关键手段之一。肿瘤类器官，尤其是包含 TME 成分的肿瘤类器官，能够帮助监测和促进 CAR 细胞向肿瘤的募集，增强其杀伤效果，是评估 CAR - T 细胞疗效和肿瘤特异性的有效平台。研究人员将 MUC1 - 和 EGFR VIII - CAR - T 细胞分别与肿瘤类器官共培养，证实了这两种 CAR - T 细胞靶点的抗肿瘤功能。在培养表达 HER2 的 CRC 类器官时，发现单独添加抗 HER2 CAR - T 细胞对类器官的杀伤力较小，但与 birinapant 联合使用时，能够显著增加类器官的死亡，这种致死作用还归因于 CAR - T 细胞衍生的肿瘤坏死因子的旁观者效应，即使没有与 CAR - T 细胞直接接触，也能诱导类器官凋亡。虽然到达肿瘤的 CAR - T 细胞数量较少，且肿瘤穿透能力有限，但这种联合治疗能够启动有效的杀伤作用，克服了 CAR - T 细胞治疗中面临的一些挑战。Chiriaco 等人设计了两种 MET - CAR 构建体，并在 MET 过表达模型中评估了它们的细胞毒性活性，发现这两种构建体都能够克服对针对 MET 的小分子靶向药物的耐药性。Schnalzger 等人报道，CRC 类器官可以作为评估 CAR 治疗中靶抗原和肿瘤细胞特异性的个体平台。Votanopoulos 等人描述了一种将患者特异性成熟淋巴结抗原呈递细胞整合到类器官中的系统，该系统能够诱导过继免疫，展示了其在预测和阐明过继免疫治疗反应方面的潜力。
总结与展望
癌症免疫治疗为肿瘤治疗带来了革命性的变化，但目前仍然缺乏强大的测试平台，尤其是在个体水平上选择最佳治疗方案方面。一个有效的癌症免疫治疗测试平台不仅要包含肿瘤细胞，还应包括具有免疫成分的 TME。
近几十年来，PDTOs 与免疫细胞共培养在研究免疫治疗疗效和耐药机制方面展现出了巨大的潜力。然而，由于缺乏基质成分，类器官技术在全面捕捉 TME 对癌症行为的影响方面仍然存在局限性。为了克服这些限制，科研人员开发了包含免疫细胞、CAFs 和血管的复杂类器官共培养体系。但目前仍面临一些挑战，例如优化基质成分的长期保存条件、维持肿瘤异质性，确定在类器官中应保留的各种基质细胞群体的程度，以及优化培养基成分以支持所有克隆的生长，同时避免对特定亚群的偏好。此外，由于机械应力对细胞和组织生理学具有重要影响，控制肿瘤类器官中各种细胞类型的形状、数量、大小和相对分布，对于确保药物筛选和测试的可重复性至关重要。
目前，关于 PDTOs 在癌症中的临床应用，大量的临床试验正在进行中。在未来，复杂肿瘤类器官有望成为个性化免疫治疗验证、治疗反应和毒性预测、新治疗策略选择以及药物开发的有前景的平台，为癌症治疗带来新的突破和希望。
