《Virology Journal》：Long-term culture of chicken tracheal organoids for the purpose of avian influenza virus research
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为解决缺乏代表禽类呼吸道的体外原代细胞培养系统以研究高致病性禽流感病毒（HPAIVs）等病原体的问题，研究人员开展鸡气管类器官（CTOs）的分离和长期培养研究。结果显示 CTOs 可长期培养和分化，能用于研究禽流感病毒。这为研究禽类呼吸道及宿主 - 病原体相互作用提供了新工具。
禽流感，这个听起来就让人胆战心惊的词汇，一直以来都是禽类健康乃至人类公共卫生安全的巨大威胁。在全球范围内，家禽养殖业规模庞大，然而，各种病毒、细菌和寄生虫引发的传染病不断侵袭着这些家禽。其中，禽流感病毒（AIVs）凭借其强大的杀伤力和潜在的人畜共患风险，让人们谈之色变。高致病性禽流感病毒（HPAIVs）一旦爆发，会导致家禽大量死亡，给养殖业带来毁灭性打击，还可能跨越物种屏障感染人类，危及人类生命健康。但目前，由于缺乏能够准确模拟禽类呼吸道环境的体外原代细胞培养系统，科学家们对禽类宿主与病原体之间相互作用的研究受到极大限制。此前，虽然有不少科研人员尝试建立禽类类器官培养体系，但大多集中在肠道领域，对于禽类呼吸道细胞的长期培养，一直没有找到理想的解决方案。
在这样的背景下，来自荷兰伊拉斯姆斯大学医学中心（Erasmus University Medical Center）等机构的研究人员，决心攻克这一难题。他们开展了鸡气管类器官（CTOs）的分离和长期培养研究，旨在建立一个能够有效模拟禽类呼吸道环境的体外模型，深入探究禽流感病毒与宿主之间的相互作用机制。这项研究成果发表在《Virology Journal》上，为禽类呼吸道疾病的研究开辟了新的道路。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：首先，从 18 日龄鸡胚胎或 21 - 23 日龄鸭胚胎获取气管组织，分离培养类器官。其次，利用免疫荧光（IF）技术检测细胞标记物，判断细胞类型和分化情况。再者，通过病毒组织化学方法研究病毒与细胞的结合模式。最后，构建上皮 / 内皮共培养体系，研究病毒在不同细胞中的复制情况 。
鸡和鸭气管类器官的制备方法
研究人员选取鸡和鸭胚胎作为样本来源，从 18 日龄鸡胚胎或 21 - 23 日龄鸭胚胎收集气管。通过 dispase 消化基底膜，机械力进一步解离上皮细胞，去除杂质后，将细胞重悬于基底膜提取物（BME）中，置于含有多种生长因子的 AO 培养基中培养。在 39℃环境下，约 6 小时即可形成类器官。这种方法利用胚胎组织，避免了牺牲成年动物，且胚胎样本获取相对容易，成本较低。
鸡和鸭气管类器官的增殖与特征
鸡和鸭气管类器官在 BME 穹顶中培养，AO 培养基每三天更换一次，每周通过移液器机械传代。在传代过程中，发现前期有少量成纤维细胞污染，但随着传代次数增加，污染逐渐减少。鸡气管类器官（CTOs）可成功传代三个月，而鸭气管类器官（DTOs）在传代约一个月后失去增殖能力。对 CTOs 进行特征分析，发现其在早期传代时形态多样，到第五至六代后多为薄壁形态。免疫染色显示，CTOs 包含基底细胞（表达 p63）和杯状细胞（表达 muc5AC），但未检测到纤毛细胞，表明其在三维培养系统中黏液纤毛分化不佳。
CTOs 在气液界面（ALI）的分化
为促进 CTOs 的黏液纤毛分化，研究人员将其接种在 Transwell（TW）膜上，在 ALI 条件下培养。实验对比发现，纤连蛋白包被的 TW 膜比大鼠尾 I 型胶原更能提高接种效率。通过 4kDa 葡聚糖通透性测定和跨上皮电阻（TEER）监测，证实了细胞层完整性良好。在培养过程中，观察到 CTOs 在接种后约七天开始出现纤毛摆动，表明细胞发生分化。免疫染色结果显示，分化后的 CTOs 包含纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞，且表达紧密连接蛋白，形成了较强的屏障。但遗憾的是，CTOs - 衍生的 2D 培养物在 ALI 培养两到三周后，细胞层会出现孔洞，细胞脱落，导致培养物失去活力。
禽流感病毒与 CTO - 衍生上皮的结合
研究人员利用病毒组织化学方法，比较了人类季节性 H3N2 流感病毒和禽流感 H5N1 病毒在 CTO - 衍生的 2D 培养物、成年鸡气管以及哺乳动物呼吸道组织上的结合模式。结果发现，H5N1 病毒能与 CTO - 衍生的 2D 培养物和成年鸡气管的顶端细胞层结合，而 H3N2 病毒则不能。这表明分化后的 CTOs 与成年鸡气管具有相似的受体分布，为研究禽流感病毒感染机制提供了重要依据。
AIV 在 CTO - 衍生 2D 培养物中的复制
研究人员分别用低致病性禽流感病毒（LPAIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）接种 CTO - 衍生的 2D 培养物，评估其对病毒的易感性和支持多轮复制的能力。病毒滴定结果显示，LPAIV 和 HPAIV 在 CTO - 衍生的 2D 培养物中均能高效复制，表明这些培养物表达了激活两种病毒血凝素（HA）的蛋白酶。在接种 48 小时后，组织学分析显示上皮细胞层完整，免疫染色发现病毒感染细胞数量减少，纤毛细胞数量也有所下降。此外，构建上皮 / 内皮共培养体系后发现，HPAIV 在共培养体系的内皮细胞中检测到的数量比 LPAIV 更多，且只有 HPAIV 感染的内皮细胞呈核蛋白（NP）阳性，这与自然感染情况下 HPAIV 在鸡体内的复制情况相符，即 HPAIV 可在鸡的内皮细胞和上皮细胞中复制，而 LPAIV 主要在上皮细胞层复制。
综上所述，研究人员成功建立了鸡气管类器官（CTOs）的长期培养体系，并对其进行了黏液纤毛分化。CTOs - 衍生的 2D 培养物可作为研究禽流感病毒的有效模型，为深入了解禽流感病毒与宿主的相互作用机制提供了有力工具。不过，目前 CTOs 培养仍存在一些问题，如鸭气管类器官难以长期培养，CTOs - 衍生的 2D 培养物在 ALI 培养时存活时间较短等。未来研究可尝试优化培养条件，例如使用禽类来源的生长因子、细胞外基质等，以进一步完善这一模型系统。这一研究成果对于防控禽流感疫情、保障家禽养殖业健康发展以及维护人类公共卫生安全都具有重要意义，有望为开发新的防控策略和治疗方法提供理论基础。
