通过新型C1转移途径增强甲基供应提升大肠杆菌中5-甲基四氢叶酸产量的研究

本研究针对微生物合成5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）甲基供应不足的瓶颈问题，中科院青岛生物能源与过程研究所团队创新性引入Wood-Ljungdahl途径构建外源C1转移通路，结合THF合成途径强化和代谢竞争途径敲除，使工程菌株在5L生物反应器中产量达8.2 mg/L，创目前报道最高水平。该研究为5-MTHF的绿色生物制造提供了新策略，发表于《Microbial Cell Factories》。

　　

在人类健康领域，叶酸（维生素B₉）作为核酸和氨基酸甲基化过程的关键辅因子，其缺乏与神经管缺陷、心血管疾病等多种疾病密切相关。其中L-5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）是血液中唯一具有生物活性的叶酸形式，目前主要依赖化学合成生产，存在手性分离困难、环境污染等问题。虽然微生物合成具有绿色可持续优势，但受限于甲基供应不足和代谢网络复杂，产量始终难以满足工业化需求。传统通过增强甘氨酸/丝氨酸降解途径增加C1供体的方法效果有限，亟需开发新型甲基供应策略。

针对这一科学难题，中国科学院青岛生物能源与过程研究所的Wen Liu、Rubing Zhang等研究人员在《Microbial Cell Factories》发表研究，创新性地将产甲烷菌和厌氧细菌的Wood-Ljungdahl途径引入大肠杆菌，构建了从乙酰-CoA裂解获取甲基的新型C1转移通路。通过异源表达甲烷嗜热菌的乙酰-CoA脱羰基酶CdhC₂、热醋穆尔氏菌的铁硫蛋白AcsCD和甲基转移酶AcsE，实现了甲基从乙酰-CoA经CH₃-CoFeSP中间体向5-MTHF的高效转移。结合强化四氢叶酸（THF）合成关键酶（FolE、FolP、PurU）和敲除甲基消耗途径（metE），最终使工程菌M3012在5L发酵罐中产量达到8.2 mg/L，创下微生物合成5-MTHF的最高纪录。

研究采用的关键技术包括：1）基于λ Red重组系统的基因敲除；2）同位素标记实验验证甲基转移路径；3）钴胺素转运蛋白过表达增强辅因子供应；4）UHPLC-MS/MS代谢产物检测；5）5L生物反应器补料分批发酵工艺优化。

研究结果部分，"设计构建新型甲基供应途径"显示，通过引入CdhC₂-AcsCDE复合体系成功建立了乙酰-CoA→CH₃-CoFeSP→5-MTHF的甲基转移链。同位素标记实验证实，使用氘代乙酸能特异性生成D标记的5-MTHF，验证了该路径的功能性。"增加前体供应提升产量"部分发现，过表达GTP环化水解酶（FolE）、二氢蝶酸合酶（FolP）和甲酰四氢叶酸脱甲酰酶（PurU）使5-MTHF产量提升1-2倍，三者共表达菌株M3012摇瓶产量达1.075 mg/L。"减少降解途径"环节显示，敲除甲硫氨酸合成酶基因metE可阻断甲基消耗，使产量进一步提高48%至1.59 mg/L。

该研究通过多策略协同优化，首次实现了Wood-Ljungdahl途径在好氧宿主中的功能重构，为C1代谢工程提供了新思路。所开发的8.2 mg/L高产菌株使微生物法生产5-MTHF的工业化成为可能，对解决当前化学合成法的环保和手性问题具有重要意义。未来通过优化胞外分泌和抗氧化保护等措施，有望进一步提升生产效能。这项工作不仅为叶酸营养补充剂的绿色制造开辟了新途径，其构建的模块化代谢工程策略也可推广至其他高附加值甲基化产物的生物合成。