《BMC Plant Biology》：Integrated genomic and transcriptomic analysis reveals the mechanisms underlying leaf variegation in ‘Gonggan’ mandarin
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为探究 “贡柑” 叶片斑驳变异机制，研究人员开展了基因组与转录组整合分析研究。结果发现关键基因表达紊乱影响叶绿体发育和色素代谢，导致叶片斑驳表型。该研究为 “贡柑” 功能基因组研究和种质改良奠定基础，也为柑橘颜色变异机制提供新见解。
在植物的奇妙世界里，叶片斑驳现象就像大自然精心绘制的独特画卷，吸引着无数研究者的目光。在全球超过 1700 种植物中都能观察到叶片斑驳，其不仅具有极高的观赏价值，更是研究光合作用色素代谢、叶绿体发育以及光合效率的理想模型。然而，这一现象背后的分子机制却如同隐藏在迷雾中的宝藏，一直未被完全揭开。
“贡柑”，作为广东省肇庆市的特色地方品种，有着 “柑橘之王” 的美誉，它集合了柑橘和甜橙的优良品质。近年来，研究人员通过芽变获得了一种叶片呈现黄色斑驳表型的 “贡柑” 新变种，这为深入探究叶片斑驳的奥秘提供了绝佳契机。
为了揭开 “贡柑” 叶片斑驳变异的神秘面纱，浙江农林大学、广东省农业科学院果树研究所的研究人员展开了一系列深入研究。他们对正常和斑驳 “贡柑” 进行了全面的基因组和转录组分析，同时结合细胞学和生理学特征检测，从多个维度解析叶片斑驳变异的机制。研究成果发表在《BMC Plant Biology》杂志上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，对 “贡柑” 的基因组进行测序，采用 PacBio HiFi 测序平台，之后通过 hifiasm 软件进行初始组装 ，并利用 NextPolish 软件进行校正，去除冗余序列。其次，进行转录组分析，构建文库并使用 Illumina NovaSeq 6000 平台测序，处理数据并进行基因定量和差异表达分析。最后，运用加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建基因共表达网络。
细胞学变化
通过观察发现，“贡柑” 斑驳叶片呈现不规则的白色和绿色区域，部分叶片甚至完全白化。透射电子显微镜（TEM）观察显示，绿色叶片和斑驳叶片绿色区域的叶绿体形态和结构正常，而斑驳叶片白色区域和白化叶片的叶绿体则严重缺失或发育不良，这表明叶绿体生物发生缺陷是导致白化表型的原因。
叶绿体相关活性
测量光合作用参数发现，斑驳叶片的净光合速率（Pn）、胞间CO2?浓度（Ci）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）相较于绿色叶片显著降低，同时叶绿素荧光参数也发生明显改变，非光化学淬灭（NPQ）和非光化学淬灭系数（qN）大幅增加，这表明斑驳叶片通过增强光保护性能量耗散来应对光化学能量转换的降低。此外，斑驳叶片白色区域和白化叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量显著低于绿色组织，且类胡萝卜素的组成也发生了变化，这表明色素代谢的改变与叶片斑驳变异密切相关。
基因组组装与比较基因组学
对绿色和白色叶片进行基因组组装，结果显示两者基因组完整性和结构良好。比较基因组分析表明，“贡柑” 与柑橘（Citrus reticulata）的亲缘关系比与甜橙（Citrus sinensis）更近，并且鉴定出一些快速进化的基因家族和相关功能富集。
斑驳叶片的转录组谱
转录组分析发现，不同叶片类型之间存在明显差异。主成分分析（PCA）将样本分为四组，白色区域与绿色叶片比较的差异表达基因（DEGs）最多。差异表达基因的聚类分析表明，与光合作用相关的基因在绿色叶片和斑驳叶片绿色区域高表达，而与核糖体生物发生、苯丙烷生物合成和糖代谢相关的基因在白化叶片和斑驳叶片白色区域高表达。此外，还鉴定出许多转录因子（TFs），其中部分在白化和斑驳叶片中下调。
叶绿体发育和叶绿素代谢相关基因的转录调控
分析参与叶绿体生物发生和叶绿素代谢的关键基因和转录因子表达，发现多个与叶绿体发育相关的基因如TOC159、PDV2、THA8和SIG5在白化和斑驳叶片中下调，而参与叶绿素降解的基因表达变化多样，如CLH2、SGR等在白化和斑驳叶片白色区域上调。启动子区域的基序分析表明，基因表达差异可能与基序数量和分布变化有关，且转座元件（TEs）可能影响基因表达。
鉴定与叶绿体发育和叶绿素代谢相关的基因调控模块
WGCNA 分析确定了 13 个共表达模块，其中绿色 - 黄色模块与叶绿素a、b呈负相关，与部分类胡萝卜素呈正相关，该模块基因参与调节叶绿素和类胡萝卜素代谢平衡；棕色模块富含与 RNA 修饰和 ncRNA 加工相关的基因，包含多个与叶绿体发育相关的转录因子；tan 模块与叶绿素a呈正相关，与部分类胡萝卜素呈负相关，参与芳香化合物分解代谢等过程。进一步分析模块的调控机制，发现不同模块存在特定的转录因子和基序调控网络。
研究结论表明，“贡柑” 叶片斑驳变异是由多种复杂机制共同作用导致的。关键基因如TOC159、PDV2、THA8和SIG5的下调损害了叶绿体发育，而CLH2、SGR、NOL和NYC1等基因的上调加速了叶绿素降解。启动子基序的变化进一步影响了这些基因的表达，最终导致叶绿体结构异常和叶绿素含量降低，形成叶片斑驳表型。
这项研究首次公布了 “贡柑” 的基因组，为柑橘的进化研究和分子育种提供了宝贵的基因组资源。研究结果不仅揭示了植物叶片斑驳变异的分子机制，还为柑橘种质改良提供了潜在的靶点，有助于培育出具有独特观赏价值和优良农艺性状的柑橘品种，在柑橘栽培的观赏和农业领域都具有重要的推进意义。
